「細胞内成分のコンタミ」 ご教授下さい。

質問

「細胞内成分のコンタミ」　ご教授下さい。
あるタンパク質が細胞外に分泌されるかどうかを検討しています。
ベクターのトランスフェクション後4日間培養し、その培養液をウエスタンしたところ、
はっきりとバンドが確認できたのですが、
細胞が死んでエンドのタンパクである可能性が否定できません。
そこで、これが細胞内成分のコンタミではないことを証明したいのですが、
何か良い方法はないでしょうか？
今のところ、分泌阻害をかけてみようと思っていますが、
何か良い試薬はありますか？また、良いアイディアがありましたらご教授下さい。

回答No.2

otx

まぁ、死んだ細胞から細胞質が流出してきたために、
そのタンパク質が培養液中にある可能性を否定したいのでしょうから
遠心やフィルターでは対応できないことは質問者さんも思っていらっしゃるでしょう。

で、私だったら少なくとも２つの策を考えます。

１、トランスフェクション後の培養液中に、
細胞質に存在することがわかっている他のタンパク質がウエスタンで検出されないことを示す。

２、トランスフェクションによる一過性の発現系ではなく、
　そのタンパク質をstableに発現するクローンを数種類単離して、死んだ細胞がいない状況でも
　培養液にそのタンパク質が存在するか確認する。

こんなところでしょうか。参考までに。

お礼

貴重なご意見ありがとうございました。
１）を参考にしまして、細胞外に分泌されない構築のタンパク発現ベクターとco-transfectionすることにしました。
また、Brefeldin Aによる分泌阻害も試してみようと考えております。

お礼が遅くなってしまい申し訳ありませんでした。
ありがとうございます。

回答No.1

alanami

細胞上清を遠心して、その上清をフィルトレーションすれば
細胞の死骸は除去されるのではないでしょうか。