タンパク抽出について

質問

細胞からタンパクを抽出してウエスタンブロットをする予定です。
今、ＫＩＴを使用して歯根膜細胞からタンパク抽出をしているのですが、ＰＢＳでの細胞回収で遠心してもペレットが沈澱しません。

プロトコールには４５０×g　５分と記載されていますが、沈澱しないので１０分しましたがだめでした。

どのようにしたらよいか教えてください。
よろしくお願いします

回答No.4

qrl

そもそも同じ研究室に相談できる研究者はいないのですか？基本的なところでミスをしている可能性が高いですから、こういうところに答えを求めるよりは、周囲に聞いた方がよっぽど早いのでは？
それはさておき、dishの培養細胞の量はいかがでしょう。sub-confluentの状態ですか？極端に少なくないですか？
スクレイパーで集める際にしっかり隅々まで集めていますか？
全量しっかりチューブに移せていますか？

補足

回答ありがとうございます！！

研究室の人たちには相談済みなのですが、ウエスタンをやったことのある人がいないため、答えがでないのです・・・・・

また大学内でも派閥があり、、、、、、

スクレーパーを用いてきちんと移してます。。。。confluentでもあります。

細胞量が足りないんでしょうか？？？
今週ＤＩＳＨ３枚でやってみる予定です、

回答No.3

nonnon1190

細胞を集める時の遠心力としては別に問題ないと思います。
一桁もあげたらつぶれます。ホモジナイズしたいなら別ですが。

さて、kitを使っているのにできないというのは、重症です。
なにせ、簡単にできるようにkitになっているのですから。

ここで質問するなら、kitは何かを少なくともあげないと何とも言えません。

個人的には、質問する前にkit付属のプロトコールをきちんと熟読する、これが先かと思います。

きちんと読んで考えていないのではないですか？

補足

回答ありがとうございます。
ＱＩＡＧＥＮのQproteome Mammalian Protein Prep Kitです。

はじめてこのような場所で質問させていただき、ルールやマナーがわかっていなく、申し訳ありません。。。。。

回答No.2

qrl

どういったキットを用いたのかを示していただかないことにはなんとも答えにくいのですが、細胞をペレットにするには450×gではちょっと足りないような。その値で回してみたことがないので分かりませんが。一桁違ってませんか？日本語に訳したプロトコールを見ているのであれば、それは移し間違えをしている可能性があります。英文のプロトコールを再確認してみてはいかがでしょうか。

補足

ご回答ありがとうございます。
ＱＩＡＧＥＮのQproteome Mammalian Protein Prep Kit
です。

プロトコールを再確認しても日本語も英語も４５０×ｇでした。

回答No.1

shinya23so

的違いだったらもうしわけないけど、マニュアルとあります。

参考URL：

http://blog.goo.ne.jp/hiroyukikanzaki/e/11e03fba46582fcc8589444263185632

補足

ありがとうございます。
一度方法を工夫してみようと思います。