細胞培養について

質問

細胞の増殖が悪く困っています。

細胞はRBL-2H3(ラット好塩基球白血病細胞)細胞株で、付着性の細胞です。
培地にはMEM培地（10％）を使っています。
培養条件は37℃で5％CO2、25cm2の細胞培養用フラスコに培地5mLで育てています。

凍結保存していた株を先月新しく起こしたところ増殖が悪く、何度起こし直しても改善されず困っています。
春から夏にかけて同じLotの株を起こして培養していた時には問題なく増殖が見られたのですが・・・

具体的には。
通常は播種から３～４日でコンフルエントになるのですが、現状では１週間経ってもコンフルエントには遠い状況です。
播種から２日目までは比較的正常のペースで増殖しているように見えるのですが、それ以降にほとんど増えなくなってしまうのです。

また最近では、細胞内に今まで見られなかった空胞を持つ個体が多く観察されるようになり、関連があるのではと疑っています。

これまでに、対策として培地の作り直し、インキュベーターの清掃等を試みましたが、効果が見られません。
何かアドバイスやヒントになりそうなことだけでも構いませんので、助言を下さいm(u＿u;)m

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

>細胞内に今まで見られなかった空胞を持つ個体が多く観察されるようになり
血清のロットが変わっていませんか？
悪い血清を使うと、そのような空砲が出る場合があります。

>凍結保存していた株を先月新しく起こしたところ増殖が悪く、
保存条件はー80度ですか？それとも液体窒素ですか？
-80度ならば、誰かが蓋を開けたときなどにダメージを受ける場合があります。
液体窒素であっても、誰かが細胞を取り出すときに一緒に外に出されていれば、ダメージを受ける場合があります。

まずは、
複数ロットの血清を用意して(可能であれば、昔培養できた実績のあるロットも含めて)
濃度も10~20%くらいの範囲で振ってみてはいかがでしょうか。

お礼

そうですか…悪い血清で空胞の出る場合があるということは初めて聞きました。
しかし、血清のLotは私の前任者の時からずっと同じものを使っているようです。
ですから血清が原因の可能性は低いと考えているのですが…、どちらにしてもそろそろ同じLotの血清を使い切ってしまうので、近いうちに新しく複数Lotでの試験をしてみたいと思います。

保存条件は-80℃です。
広く共有されているフリーザーを使用しているので、MIYDさんにご指摘頂いたようなダメージを受けている可能性も十分考えられる環境だと思います。
この点は全く頭にありませんでした。。
ご指摘ありがとうございました。

ご意見を参考に、もう一度検討・試験をしてみたいと思います。
ありがとうございました！

回答No.2

popopopooh

私も同じ細胞を培養したことがあります。

他の細胞でも同様だとは思いますが、2-3回継代するまで立ち上がりが遅かったと思うので、もう少し細胞密度をあげて培養してみてはいかがでしょうか。

お礼

細胞密度については、いま濃い濃度で試してみています。
半年前にはもっと薄い濃度でも大丈夫だったのですが・・・

2-3回継代するまで立ち上がりが遅かったというのは、私は今まであまり感じていませんでした。
そういう要素も考えてみたいと思います。

ありがとうございました！