PBMCからの単球の分離の際、細胞が接着しません

質問

「PBMCから単球の分離の際にフラスコに接着しない」について教えてください

お世話になります。
PBMCから単球を分離する際、単核球1×10^7個程度得られました。
単核球を10％FBS含むRPMIに浮遊し、FBS処理したフラスコに注入し、37℃で1hr incubationしました。
接着細胞を回収しようと思い、顕微鏡でのぞいてみるとフラスコに接着している細胞が全くおらず、細胞は浮遊したままでした。
仕方がなく、浮遊液を回収して単核球として細胞を使用しました。
浮遊液回収後にも顕微鏡で確認してみましたが、細胞はおらず、やはり接着はしていなかったものと思われます。

どうして接着しないのでしょうか？
教えていただけますか？

回答No.2

otx

＞基本的な質問で恐縮ですが、単球は接着するのでしょうか？
それともマクロファージに分化した細胞が接着しているのですか？

非常に難しい質問です。
少なくとも、マクロファージに分化しなくても単球はくっつくと思います。
私は前述の通り、単核球を２時間ほど培養して浮遊細胞を洗い流して
サイトサイン等を加えた培地を入れてマクロファージに分化させます。
ということは、単球はくっついているということです。

しかし、接着した時にPBMC中で浮遊していた単球とシャーレ等にくっついた単球が同じかどうか、わかりません。
接着するということ自体が、少なからず何かしらの刺激となると思われるからです。
実際、シャーレにくっついた細胞（PBMCではほとんどが単球である）を
一週間培養してマクロファージにした（サイトカインなどを加えず）という論文もあります。

単球の分離の方法としては、CD14抗体を使ったMACSなどをよく見かけます。

だた、論文等では、「～～～～ふうにして分離した単球」とか
「～～～～～～ふうにして分化させたマクロファージ」と
説明を入れて最初に定義するように思われます。

あくまで「～～～～～という作業をして分離した（分化させた）”細胞”」であるということを明記し、
読者にそういう細胞であると認識させる必要があると思います。

話はそれましたが、単球かマクロファージかという前に
「～～～ふうにして分離した細胞」としか私にはわかりません。
どっちか明らかにするには、細胞表面マーカーをFACSで調べるなどの
確認作業が必要かと思います。

お礼

なるほど～。とても勉強になりました。
丁寧に教えていただきまして、ありがとうございます。

回答No.1

otx

経験上、申し上げます。

１時間くらいでは接着していない可能性があります。

そして、肉眼で「かなり接着しているなぁ」と実感できるほど接着している状態を観察できないと思います。

マクロファージを分化させる時は、最初の細胞をまいて２時間くらいで
浮いている細胞を洗い流しますが、そのとき「本当にくっついている細胞はいるのか？」
といぶかしく思いがながら見ていますが、７日後くらいに見ると
多数のマクロファージが見てとれます（マクロファージになる前に分裂して増えることもあるでしょうが）。

という感じです。

お礼

ありがとうございます。

基本的な質問で恐縮ですが、単球は接着するのでしょうか？
それともマクロファージに分化した細胞が接着しているのですか？