配列、長さが未知intronのシークエンシング

質問

どこを探してもわからなく、最後の頼みとして質問させていただきます。
実は、ある遺伝子の5'-上流域3 kbをPCRで増やしたいのですが、どうしても内部特定の領域(100 bp程)が増やせません。具体的に言うと、1-2500までと2600-3000は増やせるのですが、2500-2600がどうしても増やせません。NCBIの配列を基にしており、その配列をBLASTで検索すると、やはりその100 bpがぽっかりと適合しません。そこでNCBIが間違っており、もっと長い配列が埋まっていると考えロングPCRを行いましたが、うまくいきません。そこで以下の二点についてご存じの方、教えていただけないでしょうか。
(1)Intronの未知配列(両端の配列はわかるが、その配列が何bpかは不明)をシークエンシングしたい場合、どう行うか。
(2)NCBIの配列に間違いがあるのか(人種やSNPなどではなく、大部分の配列)。
転写因子についての実験を行いたいので、配列がわからない、また増やせなければどうしようもありません。勉強不足ではありますが、未知exonならcDNAを使えば行けそうな気がしますが、intronはそうはいかず、またショットガンなどは大規模な処理装置が無い場合不可能と認識しております。配列および長さが未知のintronのシークエンシングは不可能なのでしょうか。何卒よろしくお願い申し上げます。

回答No.3

kumajiro4

（もしかしたら別の回答者が答えているかもしれませんが、）
私だったら、まず、1-2500のフラグメントの2400ぐらいのところにFプライマー(1)を、そして2600-3000のフラグメントの2700ぐらいのところにRプライマー(2)を作成し、
(1)と(2)でPCRをやる。当然リーゾナブルのサイズが出るはずなので、その配列を---。
と考えますが、

ただ、文面から、《ロングPCR----うまくいきません。》とありますが、
普通のTaqでも十分3ｋｂはいきますよ。---条件があえばですが。ただし、配列にミスが多いのは事実です。ですから、そのシークエンシングは賛成できません。
あえてロングPCRと言うのであれば、20ｋｂは増えますよ。条件次第で40ｋｂ以上も。
（ただし、短すぎるとかえって増えませんよ。）
ちなみに私は、結構PCR条件は時間をかけて慎重に検討しています。特に初心者には、サイズだけを頼りに○×を判断するので、数回で成功しても結構勘違いしていることが多いのも事実です。

（チョット脇に入ってしまいましたが、また話を戻して、）

それで増えないのであれば、2500-2600のところにかなり長い配列が入り込んでいる？と考えるのが普通でしょうが、その前に、

配列が特徴的、例えばATリッチとか、繰り返し配列とか、パリンドロームを形成しているとか、---。そんな時はPCR反応液に入れる鋳型DNAをアルカリ処理や熱処理するだけでも効果が出ます。

あと、プライマーもチョットずらして作るだけで意外とすんなり進むこともあります。
最近はプライマーを外注しても安いですから、いろいろ試せます。

などなどと考えると、切りがないのですが。

よくあるケースとして
PCRの鋳型のDNAを制限酵素で処理してもカットできない！ことも多く、純度を上げるために精製を繰り返すと絶対量が減ってしまい、---と言って純度を上げるため特にゲル抽出したりすると、かえってアガロースがPCR反応を妨害したり、---などなど。

単純に鋳型に純度が悪くて増えない？---と言う可能性はどれくらいですか？

次にデーターベースは結構がミスがあると思います。事実、いくつかミスを見つけて投稿しました。
と言っても数個の話であって、100ｂは経験がありません。
また、種によっても違っていることもあると思います。この件も幾つか経験がありますが、投稿していません。変異が入りやすいのか、幾つかのクローンをチェックしましたが、幾つかのパターンがあり、PCRの段階で変異が入ったのか？どこで変異が入ったのか？正直深入りするのを止めました。

いろいろ経験で書きましたが参考になれば幸いです。
では、頑張って。

お礼

丁寧なご回答、誠にありがとうございます。
市販のTaqで3 kb程度なら普通に(おそらく5 kb程でも)増えることは認識しております。
ご回答いただいたように、私も未知配列の±100 bp程にプライマーを設計し(4パターン程)試したところ、全く単一のバンドは得られませんでした(アニーリングは46-66℃)。
テンプレートはヒト血液から自動抽出装置を用いて行っており、他の遺伝子などすべてのPCRで増幅されることから、吸光度は測定しておりませんが純度は問題ないかと思われます。
ロングPCRでは専用のポリメラーゼでエクステンション5分でアニーリングは説明書通り66℃で行いました。しかしバンドは確認できませんでした。
ご回答くださった先生は、分子生物を専門としているのでしょうか。いまだに疑問であるのは、BLASTが参考としているゲノム配列は何を基にしているのでしょうか。BLASTでNCBIの配列を入力した際、その未知配列がぽっかりと検索にひっかかりませんでした(未知80bp以外の配列は大丈夫でした。→□→な感じで真ん中だけ抜けます)。しかし、なぜか結局は間違った配列にリンクしてしまいます。おそらくBLASTは色々なところから報告された配列をまとめて検索していることと思うのですが(NCBI含む)、BLASTで未知配列が引っ掛からないことから、そのBLASTが基にしている配列にリンクできればすべて解決するように思います。ずっとパソコンはいじっているのですが、今のところ当たりにたどり着いておりません。
配列の種差は確認しております。またNCBIの配列は人種が日本人とは限らないことから、人種間のSNPなどによる配列の相違も認識しております。ただ、このようにぽっかりと80 bpも間違うことがあるのか疑問だったところ、ご回答いただいたようにあまり見かけないケースということでしょうか。
今までもうまくいかないPCRはありましたが、検討を重ねてすべて成功させてきました(遺伝子全エキソンの多型探索などを行っており、おそらく100領域以上のにはなるとおもいますがすべて成功しています)。ここまでうまくいかなかったことははじめてです。イントロンや遺伝子5'上流域などはcDNAのように販売もしていないことと思います。
お忙しい中、ご回答誠にありがとうございます。

回答No.2

browntraut

A No.1です。

そうですね。
具体例にあるように1-2500が○で、2600-3000も○であれば、
1-3000を増やしてみては如何ですか？普通にやって増えない長さではないと思います。
もし増えればそれをテンプレートにすれば良いと思います。

それが無理ならゲノムからのシーケンシングになります。やったことはありませんが、
ゲノムのPCRは普通にやって（クルードなテンプレートデモ場所によって）かかるので
その延長上にあるサイクルシーケンスも大丈夫かと思います。
ゲノムDNAはゲノム精製ができそうなカラムでやるのが簡便だと思いますが、なければ
フェノクロ&エタ沈でも良いと思います。

重要なのはテンプレートの適度な除タンパクと、何よりプライマーの設計でしょう。
わずか数キロのDNA断片と違い、ゲノムの長さのなかでお手持ちのプライマーが
非特異的に結合すればダブルピーク、トリプルピークが出てしまうと思います。
ただ、やってみないとわからないですので、まず、1プライマーで読んでみて、
ダメそうだったら、別の位置からやってみても良いと思います。

回答No.1

browntraut

１）ですが、既知の配列１-未知の配列-既知の配列２とつながっているとして、

既知の配列１のお尻からセンスプライマーで
もしくは、既知の配列２の頭からアンチセンスプライマーで読めば
もし、空白の配列があるならば、読めます。

ただし、読みたい配列の直前もしくは直後にプライマーを設計すると100bp程ロスしますので読めません。
よって、100bp程上流にプライマーを設計するのが良いでしょう。
それで未知の配列が読めなければ、その配列はなかったことになりますね。

読むだけでなく、イントロンが欲しくてもどうしても増やせないのであれば、
100bpくらいなら合成でどうにかなります。

ご検討ください。

お礼

早速のご回答、誠にありがとうございます。もう少しお伺いしてもよろしいでしょうか。
まず、シークエンシングには綺麗で十分な量のPCR産物テンプレートが必要であると認識しており、ゲノムから直接シークエンシングができるのでしょうか。ゲノムをエタ沈などで最大限に濃縮するのでしょうか。ご教示いただいた方法は考えのひとつにはありましたが、PCR産物が得られず、また長さも不明なため、PCR産物が得られなければシークエンシングが行えないと感じておりました。
お忙しいこととは思いますが、何卒よろしくお願い申し上げます。