発現目的遺伝子のイントロンとエキソン

質問

基本的な質問をさせていただきます。

ある遺伝子がコードするタンパクを発現させたいとき
一般的にはｍRNAからRT-PCRを行ってｃDNAを得ると思うのですが、

ゲノム上の目的遺伝子配列の開始コドンから終了コドンの間にイントロンがなければゲノムから増幅させてもよいですよね。

イントロンがあるかないかはgenome データベースのどこを確認すればよいのでしょうか。

例えばこの遺伝子であれば、開始コドンから終了コドンまで全てcoding region であるので、イントロンは無いとして、この部分をゲノムからクローニングしてきて良いのでしょうか。
↓

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=850532&ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Gene.Gene_ResultsPanel.Gene_RVDocSum

回答No.2

miya_0726

mRNAの情報は、先ほどの例で言いますと「Genomic regions, transcripts, and products」のところにあるNM_002046.3をクリックしますとFASTA形式またはGenBank形式で、「mRNA and Protein(s)」のところにあるNM_002046.3からはGenBank形式で取得することができます。用途に応じてどちらかから取得すればよいでしょう。

また、通常塩基配列を記載する際は、特に断りがなければ5'末端から描き始めます。これはお考えの通り暗黙のルールとして決まっています。

PCRプライマーの設計方法については、質問者様が勘違いされているのか指摘が間違っているのかわからないので、できればPCRに関するハウツー本を入手し、読むことをお勧めします。

ものすごく簡単には、
GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC
という配列があった場合、左側を5'末端、右側を3'末端としますので、この全長を増幅するプライマーを設計するとしたら
5'側プライマー　5'-GAAAAAAAAAA-3'
3'側プライマー　5'-GTTTTTTTTTT-3'
（プライマー長は適当です）
このようにします。

お礼

miya_0726さん
大変わかりやすい回答ありがとうございました。

ｍRNA情報についても、プライマー設計についても理解出来ました。
プライマー設計方法（方向？）については合っていたようです。

合ってると思いながらもあまり自分の知識に自信が持てませんでしたので、今回教えていただいて大分ととすっきりしました。

ありがとうございました。

回答No.1

miya_0726

イントロンがあるかないかは、まさに質問者様が提示されたNCBI Entrez Geneを見ればわかります。
試しにヒトGAPDHなんかを見てみると
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=2597&ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Gene.Gene_ResultsPanel.Gene_RVDocSum
このようになり、
「Genomic regions, transcripts, and products」
に描かれた絵で直線が入っていることでイントロンがあることがわかります。

イントロンがない遺伝子は理論上ゲノムからPCRでクローニングすることは可能ですが、稀にRNA Editingが行われる場合がありますので、できるならcDNAを取得したほうが確実です。

お礼

早速の回答ありがとうございます。
いまいちデータベースの活用方法がわからなかったのでためになりました。

でもそうですか。RNA　Editing　の可能性も考えなければいけないのですね。

やはりRT-PCRをやる方が良さそうですね。

それからさらに質問させて頂きたいのですが、mRNAの情報は
「mRNA and Protein(s)」のこの場合「NM_002046．3」を参照すればよいでしょうか。mRNAが色んなところにあって…。

それからもうひとつ基本的な質問なのですが、
こういったデータベースに載っているゲノム配列やmRNA配列
これは無条件に5'→3'向きに書かれているものだと思っているんですが
それで良いんですよね。

先日そのつもりでPCRのプライマーを設計したところ
設計場所が逆だと指摘されました。

私はNCBIの配列をセンス鎖として、センス鎖の上流と全く同じ配列をアンチセンス側に着く5'primer として設計したのですが…。

色々なことを聞いて申し訳ありませんが。
良ければ教えていただけませんか。