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遺伝子の転写開始部位の決定方法とタンパク質のカルシウム結合の証明方法
- 遺伝子の転写開始部位を決定するためには、cDNAの配列から転写開始位置を特定する方法や、実験的に転写開始部位をマッピングする方法があります。
- タンパク質のカルシウム結合を証明する方法としては、クロマトグラフィーや免疫沈降などの技術を用いて、カルシウムとタンパク質の結合を確認することができます。
- A遺伝子のmRNAが増殖因子の刺激により30分以内に誘導されることから、増殖因子によって直接制御されている可能性があることを証明するためには、刺激後の細胞での遺伝子発現解析や遺伝子ノックダウン実験などを行うことが有効です。
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＞ある遺伝子の転写産物の転写開始部位を決定するためにはどのような方法を用いるか？２つ挙げよという問題なのですが、どのような方法があるのでしょうか？問題文によればその遺伝子のｃDNAは手に入っているので、その配列から転写開始位置なんてすぐ分るような気がするのですが… Primer extension法、S1 mapping法 どうやってとったcDNAかが問題ですが、特殊な方法を使わない限り、通常、cDNAライブラリーにしてもRACEにしても5'側の完全長は原理的にとれません。まず、逆転写が5'末端まで届くとは限らないこと、第二に、2nd strandの合成開始点は1st standの5'端より内側になることによります。ライブラリーからとったcDNAクローンや5'RACE産物のクローンを複数調べると、5'末端はheterogenousになっているものです。 あとの二つの質問は、これだというのが思い浮かびませんが、 ＞あるタンパク質がカルシウムと結合することはどのように証明すればよいか？ カルシウムで処理したタンパク質が分子量や等電点のシフトを起こすかどうかを調べる。放射性カルシウムでそのタンパク質がラベルされるかどうか調べる。 ＞増殖因子の刺激により直接制御されている可能性がある。これを証明するにはどのような実験を行えばよいか？ どの程度「直接」であることを想定しているのかわかりませんが、ほかの遺伝子の発現を誘導することにより生じたタンパク質がA遺伝子の発現を上昇させる可能性を排除するなら、シクロヘキシミドなどのタンパク質合成阻害剤でde novoのタンパク質合成を阻害した状態でアッセイすればよいと思います。
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- geneticist12
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No2です。 ＞第二に、2nd strandの合成開始点は1st standの5'端より内側になること 3'端より内側、の間違いです。
- MIYD
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>転写開始位置なんてすぐ分る その操作を書けばいいだけです。 >カルシウムと結合 灰化など >直接制御されている可能性がある CHXなど
お礼
詳しく書いていただきありがとうございます。大変参考になりました。