レーザーマイクロダイセクションの組織片のPCR

質問

Bリンパ球のモノクローンを調べるためにリンパ小節をレーザーで切り出し、50 ng/uLほどのDNAが得られているのですが、PCRで目的部分がうまく増幅されません。ちなみにOD値は0.9～1.0が限界のようです。
PCRで上手く増幅されない原因にどんな事が考えられるでしょうか。
DNAの濃度を上げてみても改善はされませんでした。
レーザーでDNAが壊れてしまうということもありますか？
（機械はけっこう古いタイプです）

どなたか経験のある方、ご教授いただけると幸いです。

回答No.3

ga111

＞かなり離れた施設のためレーザーの波長はすぐには確認できませんが、マニュアルに従い自分で設定した項目はLASER SPOT SIZE: 30 um，POWER: 25-35mW，DURATION: 5-6 msでした。

自分で設定しないで、メーカーに必ず行くはずのお勧めの条件を教えてもらいましょう。

＞コントロールは取りましたが、必ず行くはずの切片およびレーザーを当てたPositive controlでPCRがかからず、PCR全体が失敗しているような状態です（もちろんPCRのポジコンDNAはちゃんと増幅されています）。同じブロックのパラフィン切片から抽出したDNAはPCRがかかり、レーザーキャプチャーの工程を経るとバンドが出なくなってしまいます。

もちろん、ダメなときも、同じブロックのパラフィン切片から抽出したDNAはPCRがかかることは、同時にランしてチェックしていますよね？？？　その同じブロックのパラフィン切片に、その抽出キットを適用することは可能ですか？それで抽出キットがワークしているかどうか分かりますよね？

＞また、A260/280の比が約0.9というのも気になります。おそらく抽出の際のProtease K（熱変性済み）がサンプルに混入しているので280の値が高く出ているのだと思うのですが、DNA抽出キットのプロトコールによると、95℃10分でProtease Kを失活させたら、ダイレクトにPCRサンプルとして使えると書いてありました。

さらに、Protease をしっかつさせる操作がいるかもしれません。フェノールやProtease 阻害剤など。

回答No.2

ga111

レーザーの波長が書いていないので、分かりません。レーザーが超波長のUVに属するのなら、DNAは多少壊れるでしょう。

>取っている場所は大丈夫だと思います。

これもコントロールを取りましたか？　違う場所のコントロール、必ず行くはずの切片のコントロール。
レーザーを当てたPositive Controlも取ります。

＞パラフィン切片からDNAを抽出した場合はけっこううまくPCRがかかっていたのですが、

もちろんそのDNAは他のうまくいかない実験でランしてますよね。

補足

かなり離れた施設のためレーザーの波長はすぐには確認できませんが、マニュアルに従い自分で設定した項目はLASER SPOT SIZE: 30 um，POWER: 25-35mW，DURATION: 5-6 msでした。
コントロールは取りましたが、必ず行くはずの切片およびレーザーを当てたPositive controlでPCRがかからず、PCR全体が失敗しているような状態です（もちろんPCRのポジコンDNAはちゃんと増幅されています）。同じブロックのパラフィン切片から抽出したDNAはPCRがかかり、レーザーキャプチャーの工程を経るとバンドが出なくなってしまいます。
DNA抽出はLCM用のDNA抽出キットで行い、約50 ng/uLの濃度で取れているのですが、これだけあればLCMのサンプルで十分PCRはかかるものでしょうか。
また、A260/280の比が約0.9というのも気になります。おそらく抽出の際のProtease K（熱変性済み）がサンプルに混入しているので280の値が高く出ているのだと思うのですが、DNA抽出キットのプロトコールによると、95℃10分でProtease Kを失活させたら、ダイレクトにPCRサンプルとして使えると書いてありました。

初心者のため、つたない説明で申し訳ありません。。。

回答No.1

ga111

Positive Contolは考えられる範囲でほぼ完璧に取っていますか？

レーザーを当てたPositive Contolがあればさらに良いと思いますが。

補足

さっそくの回答ありがとうございます。
取っている場所は大丈夫だと思います。
パラフィン切片からDNAを抽出した場合はけっこううまくPCRがかかっていたのですが、より詳細な部位を特定してレーザーキャプチャーをしようとしてから殆ど増幅がみられなくなりました。
レーザーでDNAが劣化するというのはあるのでしょうか。機械は初期の古いタイプなのでそれも気になっています。