cDNAをPCRしてダイレクトシーケンスしました。しかし何回してもNN

質問

cDNAをPCRしてダイレクトシーケンスしました。しかし何回してもNNNとでます。ラベリングで失敗していると思っているのですが、プロトコール通りにしているのですが上手くいきません。非常に困っています。エタ沈でペレットがたくさんでるのでDNA量が少ないということはないと思うのですが、、なにか手技のうえでコツがあれば教えてください。基本的な質問で申し訳ないです。

回答No.2

sakasagitsunen

loving-boyさん　こんにちは

プロトコール通りやっているのに、シークエンスデータがNNNNNNNNで終わってしまうということは、エタ沈で視覚的に確認した遺伝子断片は、おそらく、目的の遺伝子断片ではなかったか、あるいは、少なくともプライマーと同じ塩基配列の部位がほとんど存在しないPCRエラー箇所の多い目的遺伝子断片と考えられます。

cDNAを得る際に、エタ沈で視覚的に確認するとともに、電気泳動で目的のバンドを確認していると思いますが、その際に用いるプライマーは、サイクルシークエンスを行う際に用いた目的遺伝子断片用のプライマーでなく、ベクター由来のプライマーではないでしょうか？

この段階で、サイクルシークエンスを行う際に用いた目的遺伝子用のプライマーでPCRを行い、電気泳動で目的遺伝子断片のバンドを確認しておきましょう。

もしも、上記の方法で目的遺伝子断片のバンドを確認出来なかったならば、ベクターに導入されていた遺伝子断片はPCRエラー箇所の多い遺伝子断片であったと考えられます。

手技のうえでコツとしては、サイクルシークエンスを行う際に、用いるプライマーをベクター由来のプライマーで行えば、PCRエラーの多い目的遺伝子断片であろうとも、塩基配列の解読が行えます（自分がクローニングした遺伝子断片が何者かが分かる）。

成功を祈ります。

お礼

ありがとうございます。塩濃度が多いとPCRできない可能性ということはないのでしょうか

回答No.1

wriwri

詳しいことがわからないので可能性を列挙します。どこで、ＮＮＮがでてくるかもお書きになっていないので、全くシークエンスが出来ていないという状況としてです。

１）タンパクなどＤＮＡサンプルへのコンタミ。エタ沈でペレットが出来てもそれがピュアなＤＮＡである保証はないです。フェノール・クロロフォルム、あるいは適当なキットを用いてタンパクを除くことも考慮にいれてください。

２）プライマーがＳｉｔｄｏｗｎしていない。アニーリング温度は検討しましたか？はたらくことが明らかになっているプライマーなのですか？いくつかのプライマーは使いましたか？Ｔ７，　Ｍ１３、などＵｎｉｖｅｒｓａｌ　プライマーも同時に使いシークエンスのシステム自体が動いていることを確認する必要があるかもしれません。

３）ｃＤＮＡが極端にＧＣ－Ｒｉｃｈである。私もＧＣが８０－９０％というｃＤＮＡをシークエンスしてことがありますが、ＤＭＳＯ，温度、時間など微妙な条件を検討しました。

４）まさかとは思いますが、ｃＤＮＡがＴＥに融けているとシークエンスはできないことはご存知ですよね。

まぁ、とりあえずここらあたりから検討されてはいかがでしょうか？

お礼

ありがとうございます。フェノクロ処理をしてみようと思います。プラスミド抽出したのですが、とれたプラスミドが汚い・少ないとシーケンスできないということはないのでしょうか