ベストアンサー PEG沈殿法 2004/02/26 23:06 PEG沈殿法によるプラスミド回収法を検索したところ、 ・Ppt ・Sup という行程が出てきました。 例えば、エタ沈＞Ppt＞遠心 のような どんな操作をあらわす略語なのかわかる方教えてください。 みんなの回答 （2） 専門家の回答 質問者が選んだベストアンサー ベストアンサー wolv ベストアンサー率37% (376/1001) 2004/02/26 23:14 回答No.1 pptは沈殿、 supは上澄み、 の略記です。 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 その他の回答 (1) wolv ベストアンサー率37% (376/1001) 2004/02/26 23:17 回答No.2 沈殿：Precipitation 上澄み：Supernatant fluid 参考URL： http://www.excite.co.jp/world/text/ 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 カテゴリ 学問・教育自然科学化学 関連するQ&A エタ沈後のペレットを確実に溶解させるには プラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか？ エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、 これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたら いいんですか？ 溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。 エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。 また、大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか？ ピペットで落とすしかないんでしょうか？ また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか？ 透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。 沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。 エタノール沈澱で、沈澱が出ませんでした。 エタノール沈澱で、沈澱が出ませんでした。 環状プラスミドをエタノール沈澱しようと思い、フェノール処理→クロロホルム処理→NaOAc添加後エタノール沈澱と操作をしました。ですが、全く沈澱が生じません。 現在、溶液中にはエタノールとNaOAcとプラスミドが100μg/mL程度の濃度で共存している筈ですが、この状態からプラスミドを回収する方法はあるでしょうか？教えて下さい。 プライマーの除去について 現在リアルタイムPCRのスタンダードを作るためにPCR産物に含まれるプライマーを除去しようとしているのですが、どうもうまくいきません。 手法としてマイクロスピンカラムS-400HR（GEヘルスケア）とPEG沈を試してみましたが、どうしても500ng/ul近くあったDNA濃度が10ng/ulあたりにまで落ちてしまいます。 スピンカラムでは回転数を800～3000×g、遠心時間を1～4分など条件をいろいろ変えて試してみました。 PEG沈では上清を捨てる際沈澱も流してしまったのではないかと思い（沈澱は見えていませんでした）、エタ沈メイトで沈殿の位置を可視化して注意深く操作してみましたが結果は同じでした。 ちなみに扱っているDNAはβ-actinの部分的配列など、どれも150～200bp程度です。 DNAの長さに問題があるのかとも考え、500bpぐらいのを使ってスピンカラムとPEG沈をやってみましたがだめでした。 やはり自分に技術的な問題があるのでしょうか・・・。 どなたかご教授お願いします。 天文学のお話。日本ではどのように考えられていた？ OKWAVE コラム アルカリSDS法におけるＤＮＡとプラスミドの分離について 大学生になり、生物実験でアルカリＳＤＳを行っている者です。 アルカリＳＤＳによるゲノムＤＮＡとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは１本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。 (1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか？ (2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか？原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね？一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか？ (3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか？何かのタンパクを介しているのでしょうか？ (4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか？EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。 (5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか？ (6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね？ ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。 エタノールとイソプロピルアルコールの違い 実習書に大腸菌からのプラスミドの抽出の時、エタ沈とイソプロ沈がありましたが、この二つの違いは何でしょうか？イソプロ沈の方が、全体量が少なくて済むともありましたが、これはどうしてでしょうか？ エタ沈の方が良さそうに思えるのですが・・・。 また、ｎ－プロピルアルコールは使えないのでしょうか？よろしくお願いします。 略語がわからない 生物科の学生です。 来週から生物学の実験があるのですが、実習書に書いてある略語がわかりません。調べてみたのですがどの本にも載ってなくて困っています。 DNAの組み換え、発現の抑制、誘導という分野で、 実習書に書いてある操作手順を、きちんとした文章に直すという課題で、操作フローにかいてある、ppt、sup、cfgって言葉の意味がさっぱりわかりません。なんとなく流れ的に、ｃｆｇは遠心分離機にかける野では・・・と思うんですが、sup、pptに関しては 何をするのかよそうできないです。 塩化セシウム超遠心法 塩化セシウム超遠心法でプラスミド抽出を行っています。 超遠心してバンドを回収するとき本来バンドが赤いはずなのに白いバンドが見えました。 これって何ですか??? 白い＝EtBrは吸着してない＝プラスミドDNAではない？ ということになるのでしょうか？？？ でも今回赤いバンドが見えず、白いバンドがプラスミドじゃないとプラスミドDNAが消えたことになるんですよね… よろしくお願いします。 DNAが消えた！ 組織からDNAを採取し、フェノール→フェノクロ→クロロフォルム処理→エタ沈で回収したDNA（DNA(1)）がちょっと薄かったので、クロロフォルムに残った層から再度回収して（DNA(2)）、最初のDNAに混ぜました（DNA(1)＋(2)）。volumeを減らして濃度を濃くしたかったため、再度エタ沈したところ、DNAがなくなってしまいました（泣）(1)と(2)は濃度を測定して50ng/ul前後ありました。しかし、(1)＋(2)は100ng/ulぐらいはあるはずが、0.1ng/ulしかないんです。最後のエタ沈は、TEと1/10量の3M酢酸ナトリウム、2.5倍量のエタノールを入れて混ぜ、-80℃15分、遠心12000rpm 30minしました。70%EtOHでリンスする時に遠心機利用が他の実験者とバッティングしたため、10分くらい70%EtOHを入れたままおいてしまいましたが、4℃12000rpm10min遠心して乾燥させ、TEに溶解しました。DNAが回収できなかったのは、どこがいけなかったんでしょうか？ アルカリminiprep法によるプラスミド抽出の純度 アルカリminiprep法によるプラスミド抽出の純度 こんにちは。早速質問です。 大腸菌を培養し、シーケンスのためにMini prepでプラスミドの抽出を行いました。 （マニュアルです） その後、ＴＥに溶解し、吸光度計を用いて、ＤＮＡの濃度と純度を測定したところ、A260/A280=1.1 とかなり純度が悪くなってしまいました。（kitと比較してです。kitでは2.0ぐらいになります） その後、エタ沈をしてもなぜか純度は全く改善されず、A260/A280=1.1のままでした。 どのような操作に注意したらよいのでしょうか？ よろしくお願いします。 ガラスビーズへのプラスミドDNAの吸着について 現在実験でFlexiPrepKit（アマシャム製）を用いて、8.1kbpのプラスミド（ベクター：7.2kbp、インサート：0.9kbp）を大腸菌から回収しているのですが、どうにも回収率が悪くて先に進めません。 そこで気になったのですが、プラスミドが大きいと回収率というのは落ちるものなのでしょうか。ガラスビーズに吸着する量も減少するのでしょうか。コピー数にも関係するとは思うのですが。 ＊プラスミドは酵母大腸菌のシャトルベクター（YEｐFLAG-1）で、pUC系ほどコピー数は高くないと思います。 ＊以前に自分で4kbp弱のTAベクター（インサート含み）を回収したことがあったのですが、そのときにはいっぱい取れたので技術には問題ないと思っています。 ＊集菌は1.5mlから4.5mlまで試しましたが、回収率に有意な違いは得られませんでした。 やはり大量に培養して、低濃度のプラスミド溶液を回収し、エタ沈で高濃度にもっていくしかないのでしょうか。 よろしくお願いします。<(_ _)> グラム陽性菌からのプラスミド抽出について 私は大学院生をしており，微生物の遺伝子について研究を行っています． しかし，最近は実験をしても，期待するような成果が得られず実験が滞っています． その実験というのは「グラム陽性菌からのプラスミド抽出」です． 院生でありながらこのような質問をするのは非常に恥ずかしい事だとは分かっているのですが，最近は全然うまくいかず，非常に困っています． このグラム陽性菌が有する約120 kbのプラスミドを抽出したいのですが，アルカリ法で抽出した後にアガロースゲル電気泳動を行ってもバンドを確認することができません． また，この菌は複数のプラスミドを有しており，比較的サイズの小さなプラスミド（約20 kb以下）までは頻繁に確認することができます． 以下に実験手順を記入しますので，このような大きなプラスミドでも抽出できるようにするためのアドバイスをしていただきたいです． １．前培養：植菌して12～20時間振とう培養 30℃ LB液体培地 ２．本培養：前培養液から50 μLを5 mLのLB液体培地が入った試験管に添加，6～8時間30℃で培養 ３．本培養液全量を15 mL容チューブに移し，遠心分離． ４．培養液を捨て，沈殿にSolI 9mLを加えて激しく撹拌 ５．この溶液を遠心分離し，溶液を捨てる ６．沈殿に1 mLのSolIを加え，激しく撹拌 ７．16 mg/mLの濃度でリゾチームを溶かしたSolIを1 mL加えて穏やかに混合 ８．37℃で2時間30分～4時間反応させる．（30分を目安に穏やかに混合） ９．SolII 4 mLを加え，穏やかに混合，5分間室温で放置 １０．SolIII 3mLを加え，穏やかに混合，20～30分間氷上で放置 １１．この溶液を冷却遠心分離，沈殿は廃棄し，溶液のみを新たな15 mL容チューブに回収 １２．イソプロ 7 mLを加え，混合．室温で1時間放置 １３．冷却遠心分離を行い，沈殿を800 μLのTE溶液に溶かす １４．この溶液を1.5 mL容チューブに移し，フェノールクロロホルム溶液600 μLを加えて5分間混合 １５．遠心分離を行い，上層の溶液を新たなチューブに回収（タンパク質の層を回収しないように注意） １６．14～15の操作をもう一度行う． １７．回収した溶液にイソアミルアルコール/クロロホルム溶液600 μLを加え混合 １８．遠心分離をおこない，上層の溶液を新たな1.5 mLチューブに回収 １９．この溶液に3M 酢酸ナトリウム溶液を添加（回収した溶液の1/10量の酢酸ナトリウム溶液） ２０．この溶液と等量のイソプロを加え，室温で2時間放置 ２１．遠心分離を行い，溶液を捨て，沈殿に70%エタノールを加え遠心分離 ２２．溶液を捨て，5分程この沈殿物を乾燥させる ２３．沈殿をTEに溶解させ，サンプル完成 （この時RNAも除去しています） このような実験手順なのですが，何かアドバイス，不備な点などがあったら教えてください．宜しくお願いします（キットを使うというのは無しで・・・）． PS．この大きなプラスミドは今まで抽出できたことがないわけではなく，この一年ほどで回収できる頻度が著しく低下しているという状況です．作り置きしておいた試薬を作りなおしているのですが，なかなかうまくいきません．失敗したときのアガロース電気泳動写真も添付しておきます． DNA合成実験 DNAの合成実験の途中で、イソプロ沈と遠心をした後、鋳型DNA沈殿を取り出すため、その上澄みを吸出すという操作をしました。 鋳型DNAはできたいたのですが、なぜかｍRNAの合成には失敗してしまいました。 これって、どんな理由が考えられますか？ DNAはできていたので、沈殿まで吸い取ってしまったわけじゃないし・・・と悩んでいます。 ちなみに、同じ条件で１０班が実験したのですが、そのうち４班が失敗でした。 日本史の転換点？：赤穂浪士、池田屋事件、禁門の変に見る武士の忠義と正義 OKWAVE コラム totalRNA抽出でタンパクのコンタミ 初めてtotalＲＮＡの抽出を行ったのですが、収率やＯＤ比を測定したところ、 蛋白がコンタミしすぎていて値が1．3付近になってしまいました。 使っているのはQIAzolという試薬でグアニジン・フェノールが含まれています。 グラム陽性菌からの抽出なので機械破砕を行ったのちにクロロホルムを添加して水層とクロロホルム層に分離しました。 通常であれば上の水層にＲＮＡが回収されますよね？ 中間層のモヤモヤはタンパクらしいので、水層回収の際は８割くらいしか回収していません エタ沈を行った結果まったくと言っていいほどrnaが回収できませんでした。 心配になったのでクロロホルム層もエタ沈した結果、 こちらからはそれなりの核酸が回収できました。（これはゲノムＤＮＡなのでしょうか） 収率は上々でしたが、ＯＤ比（260/280)、(260/230)ともに1.0付近でした。 先行論文ではカラムを用いない抽出方法でtotalRNAを抽出していたため、そのプロトコルを参考に行いましたが、２回連続で失敗してしまいました。 考えられることは、 ・機会破砕が十分でない ・スタートの菌数が多い などですがいろいろと自信がありません。。。 水層にＲＮＡが溶解していない点で、もう分解されてしまっていて、 クロロホルム層の沈殿はゲノムＤＮＡでしかないのでしょうか。 アドバイスよろしくお願いします。 DNAの精製で注意する点 PCR法によって増幅したDNAを制限酵素処理しライゲーションする実験をしているのですが、PCR産物が酵素で切断できていない可能性があり(電気泳動の時点では判断つかないので)、サイト検索で調べたりなどしてDNAの精度が問題となることが多いと書いてありました。PCR産物の精製はフェノール/クロロホルム抽出後エタ沈でしています。フェノール/クロロホルム抽出→クロロホルム抽出→エタ沈一晩→エタノールで2回洗い→乾燥です。大雑把な説明ですが、 1)フェノール/クロロホルム抽出 2)エタノール沈殿 について特に注意点などありましたら助言お願いします。なお、今使っているプロトコールは他の人で成功しているものなので、それ自体には間違いはありません。 ＲＮＡ実験について 生物実験を行う上で全く知識が追い付いてないので質問させてください TotalRNAを得る過程です。 1.DEPC水とかはオートクレーブするわけですが、普通に開けてしまっていいのでしょうか？つまり、 クリーンベンチなどの無菌的な環境で使用しなくてもよいのでしょうか？（PBSとかも） 2.キットとかにサンプルの上限量とか書かれていますが、そもそもサンプルの量ってどうやって測ればよいのでしょうか？対数増殖期の微生物を集菌して、洗浄して、1.5ｍｌのチューブに0.5ｍｌ分注しているのですが、ペレットとして得られる量はまばらですし・・・。あらかじめ分注しておくチューブの重さを測定して・・・なんて面倒なことはしませんよね？ 3.得られたRNAを吸光光度計で精度を確認したいのですが細かな操作がわかりません。そもそもRNAの量ってどうやってわかるのでしょうか？ また、測定する際、得られた沈殿（エタ沈したもの）を50μｌのｍｉｌｌｉＱに懸濁させてさらに50倍に薄めて測定とかだとダメでしょうか？ 4．上で得た懸濁液って保存が効くのでしょうか？それともエタ沈状態で凍結保存でしょうか？そうなると吸光度測定とか出来ない・・・うーん、わからないです＞＜サンプルをちょっとだけ取るとか出来ませんよね？ 文章力もなくて恐縮ですが、よろしくお願いします アルカリ法について ・アルカリ法でIII液を加えた後、転倒混和していますが、某本では「ボルテックスで混和する」とありました。 ・アルカリ法の原理から考えれば、別に激しく攪拌しても問題ない、どころか、攪拌した方がプラスミドの回収率が良いと思われます。 ・そこで質問ですが、III液を加えた後、攪拌してはいけない理由、或いは攪拌しても良い理由を、どなたか教えて下さい。 ・今までは、攪拌したらゲノムがコンタミするのだろうと漠然と考えていましたが、そういうものではないのでしょうか。 遠心分離機 スイングローターとアングルローター 遠心分離機にはスイングローターのものとアングルローターのものがあると思うんですが、それらの用途を調べていたら、スイングローターは密度勾配沈殿法に適していて、アングルローターは分画沈殿法に適していると書かれていました。しかし、理由はわかりませんでした。 分かる方回答お願いします。 plasmid DNAがない 先輩から目的遺伝子が組み込まれたplasmidを、 competent cellに感染させ、増やして欲しいと 言われ実験をおこなっています。 しかし、コロニーピックアップし一晩培養した 培養上清を回収し、QIAGENのキットでプラスミドDNAの 抽出をおこなったのですが、全てDNAが10ng程度しかなく、 困っています。 私の考えでは、抗生物質含有の培地のコロニーを ピックアップし、さらにスケールアップする際も 抗生物質含有の培地で培養したので、プラスミドDNA が入っていないとは考えられないのですが、、、。 今のところ、キットでタンパク沈殿させた際の DNAの濃度をはかり、プラスミドの増殖をチェックし ようと考えています。（キットの操作には間違いは ありませんでした） 何か、考えられる原因があれば詳しい方お教えください。 ちなみに今までの実験の流れは、以下のように行いました。 １．plasmid DNA（invitrogen pcDNA3.1)を one shot competent cellに感染させる ２．アンピシリン含有LB培地によりセレクション ３．コロニーを一晩5mlのアンピシリン含有LB培地で培養しスケールアップ ４．１mlの上清回収し、プラスミドDNA抽出 多糖類の多い植物からのDNA抽出法。 多糖類が多い植物からのDNAの抽出は何かポイントがあるのでしょうか？ フェノール・クロロホルム抽出の繰り返しなどではだめでした。 フェノール法やCTAB法も定法ではだめで、エタノール沈殿が 終わったときにはペレットになっていても、それをTEに溶かすと、 粘性がでてしまい、吸光度も260nm付近にピークが来ません。 （できれば超遠心は使いたくないのですが・・・。） バッファーを暖めておくといい、等、裏技的な手法でもかまいません。 単離したDNAはサザンブロットに用いるグレードでとれればいいです。 どなたかご存じの方いらっしゃいましたら、よろしくお願いします。 この操作方法でおかしい点はありますか？ マウス組織からのRNA抽出なんですが、以下のプロトコルで実施したのですがどうもμg/μl辺りの濃度が薄いので正しい操作方法か不安です。 実験をはじめてまだ数ヶ月というのもありハンドリングが悪いのも否めないのですが、プロトコルに問題があればそれを直したいとも思っています。 よろしくお願いします。 (1)液体窒素で凍らせた組織を乳棒ですりつぶす (2)組織にtrisolを添加してエッペンチューブにうつす (3)シリンジを通す (4)室温で5分置く (5)クロロホルムを添加して約15秒voltex (6)室温で3分置く (7)14000rpm 4℃ 15分遠心 (8)上清を回収 (9)回収できた上清と等量のイソプロピルアルコールを添加 (10)室温で10分置く (11)14000rpm 4℃ 10分遠心し上清除去 (12)75％エタノールを添加しvoltexする (13)14000rpm 4℃ 5分遠心し上清除去 (14)風乾 (15)(14)後、DEPC水にsuspendする (16)OD測定 わたしがこの作業でおかしいなとおもう点はどのようにして、RNAを沈殿させているのかが分からない点なんです。 シークエンサーなどをかける際にはエタノール沈殿をすると思うのですが、ここではしていないのでなぜしないのかが分かりません。 よろしければ教えて下さい、お願い致します。 注目のQ&A 「You」や「I」が入った曲といえば？ Part2 結婚について考えていない大学生の彼氏について 関東の方に聞きたいです 大阪万博について 駅の清涼飲料水自販機 不倫の慰謝料の請求について 新型コロナウイルスがもたらした功績について教えて 旧姓を使う理由。 回復メディアの保存方法 好きな人を諦める方法 小諸市（長野県）在住でスキーやスノボをする方の用具 カテゴリ 学問・教育 自然科学 理科（小学校・中学校）化学物理学科学生物学地学天文学・宇宙科学環境学・生態学その他（自然科学） カテゴリ一覧を見る OKWAVE コラム 突然のトラブル？プリンター・メール・LINE編 携帯料金を賢く見直す！格安SIMと端末選びのポイントは？ 友達って必要？友情って何だろう 大震災時の現実とは？私たちができる備え 「結婚相談所は恥ずかしい」は時代遅れ！負け組の誤解と出会いの掴み方 あなたにピッタリな商品が見つかる！ OKWAVE セレクト コスメ化粧品 化粧水・クレンジングなど 健康食品・サプリ コンブチャなど バス用品 入浴剤・アミノ酸シャンプーなど スマホアプリ マッチングアプリなど ヘアケア 白髪染めヘアカラーなど インターネット回線 プロバイダ、光回線など
