フローサイトメトリーの解析について

質問

生物学系の学部で実験をしている大学3年生です。フローサイトメトリー（FACS）を使用して、この解析について質問があります。レーザーの散乱光には、前方散乱と側方散乱があり前者は細胞の大きさ、後者は細胞内の様子が分り、大きいほど前方散乱が大きく、また、細胞内に顆粒があるほど側方散乱が大きいことは理解しました。疑問があるのですが、死細胞と生細胞はこの2通りの散乱で仕切るとするとどのようになるのでしょうか？死ぬと細胞内に液胞のようなものが増えたり、顆粒が増えたりして、側方散乱の値が高くなるのでしょうか？前方散乱では死細胞は大きさが小さくなるのでしょうか？そしたら、前方散乱の値は、小さくなる気がします。しかし、顆粒球などもとから顆粒がいっぱいであればこの側方散乱による生死の見分け方はできませんよね？PIで染めて死細胞を見ている方法があることは知っているのですが、PI標識しなくても細胞の生死をFACSにおける散乱の度合いで示されている図（density plot）から読み取れることができるのでしょうか？それともやはり、この2つの散乱の強度では、大きさと細胞が顆粒を持つのかどうかが分り、生死は判別出来ないのでしょうか？
　また、もう一つあります。膜抗原は、死細胞でも発現しているのでしょうか？分解されなければ死んだ細胞でも発現はしている気がします。
　長々とすみいませんが、よろしくお願いします。

回答No.1

otx · ベストアンサー

FSCとSSCのことはよく理解されていると思います。
難しい理屈をこねることも重要なことですが、

ここで、死細胞では顆粒が増えたり液胞が増えるのか？と考えたり、
そこからFSCとSSCで死細胞が見分けることができるのか？と
頭の中で考えてもしょうがない気がします。

一種類の活きの良い細胞は、FACSでFSCとSSCで展開すると大体ひと固まりの細胞集団が観察されます。
FACSにかける前にその様子を見て「死んでいるっぽいな」と感じる時にFSCとSSCでドットプロットを行うと、明らかにその集団と違う細胞集団が観察されることがあります。

ここで、この細胞は死んでしまうと顆粒が、液胞がと予想して
FSCとSSCではここに死んだ細胞が観察されるはずだ、と予想することは困難です。
あくまで、活きの良い細胞集団と死んだ細胞もいる細胞集団のFCSとSSCのドットプロットを比較してみないとわかりません。

こんなとき経験上、「死んでいる細胞は、この主な細胞集団と違うここの細胞集団ではないか」と思うことがあります。
それが確かかどうか、他の方法（PI、Anexin V）で染めて、
それらで染まった細胞が、その違う細胞集団が一致するかで確認します。

こういう過程を経て、FSCとSSCで死細胞が判別できると確認できるのです。

頭の中で「生死を見分けることが顆粒がどうこう、散乱光がどうこう」
考えることだけではわかりません。

申し訳ありませんが、私は顆粒球を専門的に扱っていません。
それで顆粒球でどうなのか見ていません。

それで、質問者様の質問に回答するとすれば、通常少なくとも
「経験的に」自分が扱っている細胞についてFACSのFSCとSSCでどのように展開できるか知っています。

身近におられる先生に質問してみてはいかがでしょうか？
もしくは実際に生死を判別できるか理屈ではなくやってみることです。

＞膜抗原は、死細胞でも発現しているのでしょうか？分解されなければ死んだ細胞でも発現はしている気がします。

発現しているではなく「生きていた時に発現していたものが残っている」ことはあると思います。
しかし、経験上、死んだ細胞は抗体で染めると非特異的に染められたり（生きているときにも絶対発現していないものに対する抗体で染まったり）、死んだ細胞自体が光っていることが多いです。

解析には注意が必要です。

お礼

大変お礼が遅くなり誠に申し訳ありません。大変参考になりました。