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【免疫組織化学】同じ一次抗体、組織について複数の検出法を用いましたが結果が統一されません
- マウス小腸の神経内分泌細胞に発現する特定の神経伝達物質を検出するために、免疫組織化学的実験法を複数種類試しましたが、結果が一致しません。
- 条件が統一されているにもかかわらず、染まる細胞数や染まる細胞の部位が異なります。
- Alexa488標識二次抗体を用いた蛍光抗体法、SABC法を用いたCy3による蛍光抗体法、LSAB法によるDAB染色を試しましたが、結果が一致しません。
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寝ぼけて書いたところもあるかもしれません。 そのため、読みづらくて申し訳ありませんでした。 ＞mRNAの発現局在について よっぽど新規のものでないかぎり、論文でありますし。 ノーザンでも何でも発現場所が示してある論文等があるといいですね。 ＞検出感度について （３）はペルオキシダーゼという酵素が基質と反応して色が出るので、 時間が経つにつれ反応がどんどん進む（限度はありますが）と シグナルが増強されると思いませんか？ （１）（２）は、蛍光物質がついても光るだけで増強はありません （蛍光物質が沢山つくように工夫はされているシステムですが）。 ということと、経験上から（３）＞（２）＞（１）とあげました。 今、ふと思ったのですが、同じ数の蛍光物質があるとして、 Cy3（赤）とAlexa488（緑）ですので、赤の方が暗く見えます。 顕微鏡の性能によるところもありますが・・・ ことによると（２）＞（１）ではなく（１）＞（２）になるかもしれません。 質問者さんのそれぞれの方法で行った実験のシグナルがどのように見えているのか、 全くわからないので可能性で申し上げますが、Alexa488の像を暗くしたとこを想像するとCy3の像に見えるかも ということなら、そういうことかもしれません。 参考までに。
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- tatoo
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何度もすみません。ごっちゃになっていますのでこちらを ＞オートクレーブでの賦活化を使用して 検出法の違いによる検出結果の違いが生じた事はありますか？ 難しい質問ですが・・・、 質問者さんが挙げられた１，２，３では、検出感度は ３＞２＞１であるので、まず私は３をやってみて、 ”シグナルが強いな”と判断した場合、１（の方が好きなので）をやって結果を出してみます。 ３でシグナルがもともと弱かったり、“強いと思った”けど実際は１（もしくは２）で検出するほどの強さではなかった場合は、１（もしくは２）では出ないということは結構あります。 そういう意味では、検出法の違いで検出結果の違いということになります。 一度、その抗体で条件が決まった場合には、他の条件でわざわざ確認しないので、それでどうなるかはわかりません。
補足
普通はわざわざ他の条件で確認しないですよね‥‥ 私もやりたくはなかったです‥‥ ＞ネガコンの件について なるほど。血清によるネガコンには気付きませんでした。 やってみます。 ＞mRNAの発現局在について in situですね‥‥orz 最終手段として検討しますwwww ＞検出感度やそれぞれの検出結果について 検出感度は【2. SABCのCy3】よりも【3. LSABのDABの法】が強いんですか!!?? 勘違いしてました！ ３＞２＞１である事を踏まえると、 検出結果は‥ たしかに３では腸上皮にバック(おそらく)が強かったです。 そして、１でも十分な抗原の局在が確認されました。 ですからして、抗原の発現量の問題ではないかと思います。 しかし、２では１ほども検出ができません。 すると、問題は２だけなのでしょう。 Cy3の蛍光がへばってしまっている事は考えられますが、 抗原を認識しているCy3の蛍光は十分なものなので、 Cy3自体には問題ないと思います。 ２の実験系について抗体濃度や反応時間等を再検討してみます。 tatooさんのアドバイスのお陰で、 頭が大分整理され、やるべきことも分かってきました。 ・２での二次抗体以降の反応の条件の再検討 ・血清を用いるネガコンの検討 ・結果の再現性 ・賦活化の再検討 ・必要であればin situ こんな感じで以後の実験をしていきたいと思います。
- tatoo
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間違えました。 ＞質問者さんが挙げられた１，２，３では、検出感度は ３＞２＞１であるので、まず私は１をやってみて、 正→まず私は３をやってみて、 です。
- tatoo
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＞レンジでの賦活化は別の因子に関して条件検討を重ね、 実験系を確率したつもりです。 免疫染色は使う一次抗体によって条件を検討しなければならないので（ほとんどは同じ条件でＯＫですが）、 別の因子に対する抗体の条件がそのまま使えるかどうかはわかりません。 抗体の希釈率などなどなど、もしも抗体のデータシートがあるのならば、 それを参考にして条件をそれぞれの抗体によって検討する必要がある時もあります。 ちなみに、話題にしたので参考までに。 私の賦活化の条件は、こちらにあるDakoのものをもとにしています。 http://products.dako.jp/site/primary/abpopup.html 私もクエン酸バッファー（自作）を用いています。トリスのほうすべからくうまくいかなかったので・・・。 本当は”温浴槽による熱処理（95℃，40分間）”をしたいのですが、この温度を保つのがほかになかったので先の回答のような条件でやっています。 ＞オートクレーブでの賦活化を使用して 検出法の違いによる検出結果の違いが生じた事はありますか？ 難しい質問ですが・・・、 質問者さんが挙げられた１，２，３では、検出感度は ３＞２＞１であるので、まず私は１をやってみて、 ”シグナルが強いな”と判断した場合、３（の方が好きなので）をやって結果を出してみます。 １でシグナルがもともと弱かったり、“強いと思った”けど実際は３で検出するほどの強さではなかった場合は、３では出ないということは結構あります。 そういう意味では、検出法の違いで検出結果の違いということになります。 一度、その抗体で条件が決まった場合には、他の条件でわざわざ確認しないので、それでどうなるかはわかりません。 と、思いついたのですが、もし質問者さんが行っている実験で ”１ではシグナルらしきものが検出されているけど、２とか３では検出されていない” ということであるならば、単純にある因子の発現量が低いから、 ということではないかと思います。 ＞染まる細胞数や染まる細胞の部位が統一されません。 ３つの検出方法で、３つともでどこかしらにシグナルっぽいのが観察されて、 そのシグナルはそれそれバラバラのところにあるということでしょうか？ 一次抗体を添加しないネガコンはやってあるようですが、 例えばノーマルの血清をかけるとかいったネガコンはどうでしょうか？ 単純に、抗体自体がくっつきやすいところがある可能性もあります。 どうしようもない時は・・・ 私が免疫染色を行うときに、”ちゃんとしたシグナルである”ということを確信するときは、 質問者さんがやられたようなネガコンとの比較のほかに、 ”少なくともmRNAの発現場所と同じである（あくまでも少なくともです）” ということを観察して（もしくはすでに調べられた文献を参考にして）、確認します。 乱暴ですが、３つのうちmRNAの発現パターンと一致するのはこれしかないから、この検出方法が正しいという判断を下す（やるかやらないかは別として汗）ことはできるかもしれません。 思いつくままに乱文にて失礼します。
- tatoo
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１，２，３の方法で １における結果はいつも同じなのでしょうか？ ２における結果はいつも同じなのでしょうか？ ３における結果はいつも同じなのでしょうか？ 賦活化に、おそらく電子レンジをお使いだと思いますが、 私は電子レンジによる賦活化はコントロールが難しいと思ったことがあり（いつ沸騰しているかとか）、 しかし、賦活化専用の機械を買っていないので（売ってあります）、 オートクレーブで最低の温度105℃で30分間、賦活化を行っています。 これは単に、いつも同じ条件になるようにコントロールするためです。 他に何かあれば知っている限りでお答えできるかもしれません。
補足
はじめまして、tatooさん。 早速のご回答ありがとうございます。 ２度1,2,3を試みましたが同じ結果でした。 レンジでの賦活化は別の因子に関して条件検討を重ね、 実験系を確率したつもりです。 バッファー(0.01M Citric acid ph6.0)は沸騰したものを使用しております。 そして、バッファーは再利用できると文献に記載されておりましたが、 濃度やphの変動に不信を抱き、使い捨てで使用しています。 さらに、賦活化は1,2,3の実験で同時に、同じ容器で行っておりますので、 ムラができているとも考えにくいのです。 ただ、 A. 私は今までオートクレーブでの賦活化は試していないという事 B. 賦活化の条件とそれぞれ３種類の検出法に相性があるという可能性 C. 賦活化の再現性の違い が考えられますから、 オートクレーブでの賦活化による再実験を検討してみるのは価値がある事なのでしょうね。 tatooさんは、オートクレーブでの賦活化を使用して 検出法の違いによる検出結果の違いが生じた事はありますか？ (もちろん検出感度の違いについては無視して下さって結構です) まぁ、実験回数が２回ですから、おかしな結果とはいえ、 再現性があるとは言い難いですよね。 私自身もIHCに関して経験が浅いので、 テクニカルディフェクトが生じてもおかしくないと思いますし。 他の人の経験談なども参考にしたいと思っておりますので、 何回か同じ実験をしつつ、 オートクレーブに関する検討を行って、 もう少しこれからの方向性を考えたいと思います。 何か気がついた事がありましたら、 また、アドバイスをいただければ幸いです。 詳しい因子や実験結果を公開できない事をとても残念に思います。
お礼
複数回の同じ実験をやってみたら、結果に再現性がとれ、 そのような結果になっている理由も、抗体濃度や反応時間によって想定できました。 また、血清によるネガコンや賦活化も検討中です！！！ 今回はとても助かりました！！！ どうもありがとうございました。 返事が遅れてしまって申し訳ございません。