TCA Precipitation

質問

TCA　precipitation

Protein
　　　↓
　　　↓　　←add 2％Doc 1/100 volume (全体量に対して1/100の量のDoc)
　　 ↓
Place on ice for 15min
　　　↓
↓　　←add 100％TCA 1/10 volume
　　　↓
Place on ice for 1hour
　　　↓
c,f, 14000rpm for 10min at 4℃
　　　↓
　　　↓→→→→→→→→→→→→↓
ppt　　　　　　　　　　　 sup (溶液はとっておく)tube number (1)・(3)
↑→→↓
↑　　↓　　←add cold acetone 100μl
↑　　↓
↑　voltex for 1min
↑　　↓
↑ c,f, 14000rpm for 10min at 4℃
↑　　↓
↑　　↓→→→→→→→→→→→→↓
↑ ppt　　　　　　　　　　　 sup (溶液はとっておく) tube number (2)・(4)
↑　　↓
↑←←↓
　　　↓
Dry up 　95℃ 1~5min heat block　　(アセトンを蒸発させるため)
　　　↓
Add the 5×Loading Buffer / PBS(-)

PBS(-) 　 　　　　　 20μl
5×loading buffer 　5μl
　 　 　 　　　　　　　 25μl
って感じでTCA Precipitation（タンパク濃縮）の練習(技術習得)をしているのですが・・・実験を始めて２ヶ月で、まだ大学２年なのでネットでの検索法もイイサイトもわからず、有用性をわからないまま実験をしています。

どのような時にTCA Precipitationを用いるのかとか基本的なことから教えていただけるとありがたいです。

僕が今やっていることはロトフォアが中心なので・・・ロトフォアに詳しい方はロトフォアについても教えてください。

回答No.2

otx

テーマも決まっていないどころか、まだ実験のなんたるかもこれからだという感じなので、今この方法がどうだとか言ってもしょうがない気がします。

しかし、想像はできるのではないでしょうか？

もし、質問者様がタンパク質を精製することを目的として実験をしたとして、その時先生などから「電気泳動してタンパク質をバンドとして確認できないとダメ」と言われたとします。しかし、泳動後の染色では1μg無いと肉眼で確認できなかったとします。

しかし、精製は細胞100万個から0.1pg/mlの濃度でしか精製できないとしたら、質問者様は何万個の細胞から精製したタンパク質を泳動するためだけに精製しなければならないでしょうか？

そういうときに目的に合った実験操作をしなければ、どんでもないことになるのではないでしょうか？

それでも質問者様は「あ～でた」とだけしか言わないとしたら、実験は全く楽しいと思わないでしょうね。

本格的に研究をするようになればわかります。今は方法論をしっかり覚えて、しかるべき時のために備えるといいと思います。

方法を知っているか、知らないかで結構違います。

お礼

たびたびアドバイスをいただきましてありがとうございます。

あ～言われてみればそうですね。精製など極少量のタンパクを扱い結果を得たい場合、濃縮するまたは感度の高い銀染色（可能なタンパク量の場合）をするしかないですよね。

先生が何も言わないのは、とりあえずまずは、いろいろな技術習得をしろってことなんですかね。今は方法論をしっかり覚えて、しかるべき時のために備えたいと思います。

回答No.1

otx

＞どのような時にTCA Precipitationを用いるのかとか基本的なことから教えていただけるとありがたいです

タンパク質を変性しても良いから濃縮したいときにします。
利点は濃縮できることです。１mlの溶液に少量のタンパク質しか溶けていない場合、例えば電気泳動に1mlもアプライできないときに濃縮できるって良いですよね？しかし、「変性する」というところが気をつけ無ければならないところです。

タンパク質の濃縮について参考までに。
http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/protein_preparation/conc.asp

ですが、せっかく教えてもらった先生が現場にいらっしゃったと思います。
その先生に直接聞きましょうよ。ネットで調べるのはどうかと思います。間違ったことを平気で書き込む人がいない訳ではないです（私を含めて）

お礼

アドバイスありがとうございます。

濃縮して何をしたいんですかね？変性させてしまうのでSDS-PAGEや2-Dでは結果を得られるのはわかるのですが、TCA沈殿で濃縮させて上記のどちらかで泳動してバンドが出たとしても、『あ～出た』くらいにしか思えない自分がいます。バンドが出たから元のタンパク質の構造に・・・があると推定できるみたぃに結果を基にして考えを発展させるのですか？（すいません何もわかってないもので・・・。）

先生には先輩の残していったプロトコルを渡されTCA沈殿について勉強しておいてと言われただけで・・・質問しても話がかなり脱線してしまう人で、（細胞についても扱えるようになってほしいから先輩に細胞培養ならってね。だとか光ピンセットの研究をしているグループにもいつか入ってもらいたいだとか・・・）とにかく独学でしか情報を得る術がありません。確かにネットで調べるのは危険だと思います。うちの研究所はウイルス系なので知っていたのですがウィキペディアのインフルエンザAウイルスの増殖・複製とか間違いが酷かったです。だからこそ信頼できるサイトを見つけたいと思ったんです。（長文ですいません。）