吸光度計を用いたDNAの純度

質問

吸光度計を用いたDNAの純度は、A260/A280が1.8～2.0で高純度となり、＜1.8だとタンパクなどの不純物の存在が考えられると色々な文献で目にします。
　それでは、＞2.0の場合はどのように考えればよろしいのでしょうか？

　260nmは核酸の測定波長で、280nmはタンパクの測定波長だということはわかります。＞2.0ということは、核酸の値がタンパクの値より高いということになりますが、これは高純度と評価しても良いのでしょうか？1.8～2.0という範囲なので、高すぎても高純度とは言えない理由があるのではないかと思いますがわかりません。

　ちなみに測定値は
・260nm:0.061
・280nm:0.027
でA260/A280は約2.2となりました。

回答よろしくお願いします。

回答No.2

kgu-2 · ベストアンサー

純粋な物質には、特定の吸収スペクトルがあります。タンパクは280nm、核酸は260nmに極大吸収があり、その波長がよく利用されています。核酸やタンパクに限らず、純粋な物質は、波長の比は一定の値をとります。
　核酸では、260nm/280nmの吸光度の比だけでなく、260/240,260/250,260/270,260/280,・・・・と、純粋であれば、どの波長の吸光度比も一定の値をとります。

　したがって、純粋なDNAの260/280の吸光度比が1.8であれば、「純粋」であることは否定できませんが、保障するものではありません。
　むしろ、1.8であるハズのものが2.0ならば、純粋でない⇒不純物が混在する、と判断できます。

お礼

わかりやすい回答ありがとうございます!
参考にさせていただきます!!

回答No.1

noname#250373

>・260nm:0.061
>・280nm:0.027
>でA260/A280は約2.2となりました。

DNAの濃度が低すぎて、安定した値が取れていないせいではないでしょうか。
吸光度計の装置にもよりますが、通常260nm=0.1以上で信頼できる値が取れる事が多く、
それ以下だとbackgroundノイズの影響で正確な値が取れない事が多いです。
希釈倍率を低くするとか、DNAの濃縮、別の方法での測定などをご検討下さい。

＞2.0ということは、核酸の値がタンパクの値より高いということになりますが、これは高純度と評価しても良いのでしょうか？

誤解されているようなので補足します。
「タンパクを含まない純粋なDNA」では260:280=1.8~2という意味です。
その範囲から逸脱するということは、DNA以外（タンパクでもない）の何か（有機溶媒等）が混入している事を想定すべきです。

また、Trisなどのバッファーを使用していないと、pHの影響で波形がシフトすることもありますので、ご注意下さい。

お礼

わからない事、間違って解釈していたことが解決して助かりました。
回答ありがとうございました!!