HPLCでの定量

質問

大学１年生なのですが、学校で定量実験をしています。
ＨＰＬＣで、カロチンの標準品とサンプルのピーク面積を求めて定量したのですが、計算して出てきたサンプルの濃度が実際の値（文献値）の２倍以上の値になってしまいました。
何故こんなことになったのか考えてくるのが宿題なのですが、さっぱりわかりません。少ない値になるなら操作がまずかったんだと思うのですが、２倍以上多いとは…
色々考えてはみたのですが、全く思いつかないので、知恵を授かりたいです。よろしくおねがいします。

回答No.2

Lescault · ベストアンサー

こんにちは。再び#1です。
＞感度ミスというのはどういう状態なのでしょうか？
これはペンレコーダーを使用している場合に限られるかもしれませんが、HPLCチャートの縦軸がありますよね？その縦軸のスケールは検出器から入力する電気信号の強度を表していることはご存じかと思います。そしてペンレコーダの場合にはこの縦軸のスケールを手動で設定しないといけません（レコーダの隅の方につまみがついていると思います）。ペンレコーダでは、全部同じスケールで再生すると超微量のモノはクロマト上ですごく小さなピークになってしまいますよね（逆に大量のモノを検出すると振り切ってしまいピークの頭が見えない）？今回の場合、もし定量用標準品の測定時と濃度未知検体測定時でこの縦軸のスケールが違っていた場合、面積計算で正確な値が得られないこともあるということです（ピークの大きさが違ってきますので）。インテグレータを使用して面積を自動計算している場合には関係ないかもしれませんが、ペンレコーダを使って得たチャートから面積をマニュアル計算しているのであれば、再生時に縦軸のスケールが同一でない場合には得られるチャートが全然違ってくる場合がありますのでこの点注意が必要と言うことです。

御参考になれば幸いです。

お礼

再びありがとうございます
なるほど、縦軸の高さの調節ですか。たしかに高さがそれぞれ違う尺度だったら面積を比較しても無意味ですよね。
勉強になりました！

でも、それもきちんと調節したはずなので、感度ミスでもないみたいです。
ので、文献値があてはまらないか、標準品が実は標準からずれているか（標準品は自分で作製したのではないので。）とでも考えないと原因が思いつきません…

回答No.3

XZ400

ウーン、不思議ですね。
確かにチャートを見てみないと何ともいえませんが・・・
チョット試してみていただきたいことがあります。
カロチンの濃度を求めるサンプル（測定するサンプルのことです）に既知の濃度のカロチンを添加してみてください。
そのときにサンプルの添加した分に見合うだけのピーク面積の増加があるか？また、サンプルに標準品を添加する前のピークと比較してピーク形状に異常は無いかを確認してみてください。
これらのことを行う事によって得られたピークが本当にカロチンの純粋なピークかどうか判ると思います。
純粋なピークではない場合は当然ピーク面積が過大評価されますよね。
ピークの分離が上手くいっていないとすると、分析条件を検討する必要があるかと思いますので、がんばってください。

お礼

アドバイスありがとうございます
実はアドバイスいただいた時点で、この実験の時間が終わってしまっていまして、でも気になるので教えていただいたことを試すことはできないかと機会を伺っていたのですが、結局できないままで…先にそのこと
とお礼を付けるべきでした…お礼がすごく遅くなってしまって申し訳ありません…

結局、原因は謎のままなのですが、今回いただいたアドバイスを次の機会に生かしていけたらと思います
最後、こんなになってしまってすみません、ありがとうございました

回答No.1

Lescault

こんにちは。
製薬会社の研究所にいたことがある者です。
これだけの情報（チャートを見ていないし実際にどの様な操作をしたのかも不明）では確定的なことは言えませんが、
１．標準品定量時と実サンプル定量時それぞれの測定感度を確認してみてください。実サンプル測定時の感度が２倍になっていたら当然濃度も２倍に近い値が出てきますよね。ピーク高さで計算してみた結果はどうでしょう？やはり２倍違いますか？だとすると感度ミスの可能性が大です。
２．標準品、実サンプルはどの様に調製していますか？調製時の記録の中に計算ミスは含まれていないか確認してみてください（調製時点で既に濃度が間違っていることもたまにありますよ）
３．インジェクション量は適正だったでしょうか？
４．あまり可能性はないと思いますが、カラムや流路に汚れが残っている場合もあります（ブランク溶媒を打っているのにモノのピークが出る等）

ざっと思いつくままに書いてみました。とにかくチャート上で明らかにピークの大きさが違うのであれば、どこかに量的なミスや設定ミスがあることは明らかです（苦笑。　行った操作を最初から丹念にチェックしていくことが必要でしょう。実験ノート等記録は残っていますか？もし残っていないのであれば、これ以上の追跡は不可能です。今後は気をつけましょうね＾＾；。

以上、ご参考になれば幸いです。

お礼

お早い回答ありがとうございます！
２・３・４は大丈夫のはず…です。操作と計算は何度も確認したので、計算間違いではないと思います。（大変な思い違いをしている可能性がないとは言い切れませんが…）
標準品（1μg/ml）とサンプル（濃度不明）をそれぞれ分析して、サンプル面積/標準品面積から濃度を計算しました。

１なのですが、面積ではなく高さで計算すると、２倍よりは小さい値になりますがやはりかなり大きいです。
勉強不足で申し訳ないのですが、感度ミスというのはどういう状態なのでしょうか？