酵母破砕液の電気泳動

質問

酵母を破砕して、Niでアフィニティークロマトグラフィーをした後、
SDS-PAGEでバンドの確認をすると、40kDa付近に目的物以外のバンドが現れます。
この40kDa付近のバンドが、何のタンパク質に由来するものなのか気になります。
もしご存知の方がいらっしゃれば、ご教授願います。

回答No.1

nativepage · ベストアンサー

酵母は使ったことがないのですが、大腸菌でそういうことが起こる場合、
目的タンパク質の分解産物か、目的タンパク質の発現が途中で止まってしまったものの可能性が高いです（後者はC末にタグをつけている場合は排除されますが）。

目的タンパク質を何に使用する予定かにもよりますが、気になるようなら抗His-Tag抗体を使ってウエスタンして確認するか、ゲルろ過クロマトグラフィーなどでの分離を試みてはいかがでしょうか。

お礼

さっそくのご回答ありがとう御座います。

＞目的タンパク質の分解産物
・・・今回は目的タンパク質（２０kDa）よりも、気になるバンドは
大きいので分解物ではないと思います。
また、目的タンパク質を変えても現れるのでオリゴマーでもないと考えています。

＞抗His-tag抗体を使ってウエスタン
・・・これはやってみたところ、検出されました。
ですので、酵母の中にhis-tagと同じような構造を持っているタンパク質が
もともとあると思い、それが何なのか少し気になった次第です。

＞ゲルろ過クロマトグラフィーなどでの分離
・・・ご指摘の通り、今度行ってみたいと思います。

どうもありがとう御座います。参考になりました。

回答No.2

tatoo

使われた酵母自体のタンパク質でhis-tagと同じような構造を持っているものが存在するかは、
発現ベクターを導入していない酵母のタンパク質で同様にウエスタンを行うとバンドが出るか出ないかで、すぐに確認できると思います。

もしそのウエスタンでバンドが確認されないのであれば、私がちょっと気になるのは、
目的のタンパク質の分子量は20kDaということですが、それはDNAがコードするアミノ酸配列から予想される分子量でしょうか？
それともSDS-PAGEによって確認される分子量でしょうか？
SDS~PAGEの性質上、タンパク質の性質によって、DNAがコードするアミノ酸配列から予想される分子量とは異なる分子量として検出されることがあります。

また、酵母ということなので、目的タンパク質は糖鎖の付加はないのでしょうか？もしあるとすると分子量は大きくなります。

お礼

＞目的のタンパク質の分子量は20kDa
これは一次配列から計算によって求めた値です。質量分析でもほぼ理論値と同じ値が得られています。

＞糖鎖の付加はないのでしょうか？
糖鎖付加の配列（セクオン）はありません。バンドもスメアーにはならないので、糖鎖は付加してないと思ってます。

丁寧なご回答どうもありがとう御座います。