低分子蛋白量のSDS-PAGEについて

質問

分子量15kDaの蛋白質を15%SDS-PAGEでウェスタンブロティングしています。それまでとてもきれいに出ていてloadingする蛋白量もかえていないのにここ数週間、突然バンドがでなくなったり、でても細く極端にまがったりするようになってとても困っています。Sample buffer(loading buffer)を手作りしており、その影響かもしれないとおもって何度もつくり直すのですが同じ結果です。
何がいけないのでしょうか？

回答No.2

juns777 · ベストアンサー

質問はSDS-PAGEでよろしいのでしょうか？
ウェスタンの話のようにも思えますが、一応表題のSDS-PAGEでの話として回答してみます。
一つ一つ可能性を考えて見ましょう。

１．サンプル：以前出ていたのでしたら、変性などが考えられませんか？分解された、腐ったなど。
２．ゲル：市販のゲルでしょうか？低分子量のタンパクでしたらもう少し濃度の薄いものを使っても良いですが、市販のものでしたら変える必要は少ないと思います。
３．loading bufferは一度市販のものを使っても良いかもしれませんね。 NP0004 INVITROGEN　NP SAMPLE RED AGT 10Xを使用している場合、NUPAGE ANTIOXIDANTなどを入れ忘れていませんか？
４．電圧、時間：マーカーはきちんと流れていますか？そうでない場合は電源に問題があるかもしれません。
５．染色：ここでもマーカーは染まっていますか？何で染めているかによりますが、CBB染色などの場合、ここでマーカーが染まらなければloadingに問題があります。

ご参考になりましたら幸いです。

お礼

ありがとうございます。マーカーはきちんと流れています。電気泳動時にBPBの青い線が半分より下方ではレーン毎に曲がってしまっています。いろいろな可能性をさぐってみます！

回答No.5

juns777

＃2です。
＃4さんの補足を少々。
もしもウェスタンのトランスファーで低分子のすり抜けが心配なら、トランスファーメンブレンを2枚重ねてトランスファーしてみてはどうでしょう？過去にそうやって確認したことがあります。意外とすり抜けもある印象でした。

SDS-PAGEでCBB染色はしていますか？まず15kDaのタンパクがあることを確認するのはどうでしょうか。ウェスタンなら抗体の再利用はしない方針の教室もある位ですから再度調整しなおして見ましょう。

お礼

ありがとうございます。メンブランを2枚重ねるのは思いつきませんでした。試してみます。CBBは次回試してみます。

回答No.4

hiroU

SDS-PAGEに問題があるとすれば、他の回答者さんがお答えになった対処法方が適切だとおもいます。
加えて、補足にあったように非特異的なバンドはこれまで同様にしてきれいに見えているのだとしたら、ウェスタンについても対処する必要性があるかもしれません。
１：可能性として、使用している抗体の抗体価が低くなってしまっているかも知れません。何度も使用しているうちに抗体が古くなってしまっているなどの原因が考えられます。この場合、予測される結果の一つとして、特異的バンドは検出されずに、非特異的バンドのみが見られるという状況になり、質問者さんの状況に似ている様に思います。新しい抗体液を使ってみて下さい。
２：転写に注目すると、考えられる可能性は２つあります。１つはゲルが固いので転写されにくくなっていること。故に目的タンパク質がメンブレンへ十分転写されてない可能性です。この場合はゲルを緩くするかSDSを加えると解消されると考えられます。しかし、高分子量がうまく転写されていることを考えると原因としては薄いです。次に、低分子量なので逆に転写され過ぎてメンブレンをタンパク質が通り過ぎてしまった可能性です。この場合は、転写の際の電流を調節してみて下さい。いずれの場合も、転写後のSDS-PAGEゲルをCBB染色してみると原因がつかめます。転写されにくいことが原因の場合はゲルにバンドがハッキリと出ますし、転写され過ぎている場合にはゲルにバンドが無くなっているのに抗体反応ではバンドが検出されないという結果が得られると思います。

以上、ウェスタンに原因があると考えると、現時点では２つが思いつきました。参考になれば幸いです。

お礼

ありがとうございます。新しい抗体液でやってみます。CBBについても確認してみます。

回答No.3

blackdragon

ここ数週間、ということは、暑くなってきてからとも考えられますね。とすると、泳動時の温度が上がりすぎてしまっていることも考えられます。

対策としては、
・低温室で泳動する
・泳動の電流（電圧）を低めにする
・冷却パイプつきの泳動槽を使う
などが考えられます。

一番手軽なのは、電流を下げて、ゆっくり泳動することでしょうか。

あとは、泳動バッファーの濃度・希釈倍率などを間違って濃すぎるものを使っていても、過電流による過熱があるかもしれません。

お礼

ありがとうございます。過熱の問題については思いつきませんでした。検討してみます。

回答No.1

hiroU

バンドの形に異変が生じているのは抗体により検出されるバンドのみですか？
それとも、全体のタンパク質のバンドがおかしいですか？

補足

そうです。抗体により検出されるバンドがおかしいです。非特異的に検出される、より高分子量のバンドはまっすぐで問題ありません。