DNA変性

質問

DNAの実験をはじめたばかりの初心者です。
二本鎖DNAを一本鎖にしたいのですが、なかなかうまくいきません。
熱変性（90℃、10min、そして急冷）とアルカリ変性（7M尿素）をしました。
ご存知の方、お手数ですが教えてください。

回答No.3

cholerae · ベストアンサー

25mer程度のDNAですから，「どうやっても」簡単に乖離します。90℃で10minでも7M ureaでもどちらでも乖離しているはずです。もし，乖離していないとすると90℃の場合，溶液中の真の温度が「低い」ことも考えられますが，大丈夫でしょうか？
　多分，貴君が電気泳動をかけた時，２重鎖が検出されたのは，25merが再結合したためです。長い天然のDNAでは，変性後，急冷すると再結合（再生）は起こりにくくなります（説明は省略）。しかし，25mer程度ならば，再生可能な溶液条件ならば，もちろんちゃんと２重鎖に再結合します。
　単鎖状態を維持したいならば，中性付近の緩衝液でよいが，高い塩濃度（2M NaCl以上）で例えば高い濃度のホルムアミドを存在させることが必要です。
　まず，自分の核酸鎖の標準的な状態（Molecular Cloning, 3rd ed.参照）でのTmくらい見積もるべきです（計算用のホームページもたくさんあります）。また，実験的に乖離や再結合を判定するならば，電気泳動よりは，260 nmの吸光度から判定する方が簡単だし，便利です（溶液状態なら）。
　もし，25merをＰＣＲやハイブリダイゼーションに用いるのであれば，最初から25mer単鎖を合成して用いるべきです（この辺は貴実験の目的がはっきりしていなので明確なことはいえませんが）。
　以上，参考になれば幸甚です。

お礼

ありがとうございました！
大変、参考になりました。
さっそく、検討して実験します。

回答No.2

cholerae

nyanzowさんと同様に私も質問の補足が必要だと思います。使用しているDNAのサイズ（重さまたは長さなど），どのような方法で２本鎖の１本鎖への乖離をチェックしているのか，これらの説明が最低必要だと思います。

補足

説明不足で申し訳ありません。DNAはそれぞれ25merの短鎖です。一本鎖のチェック方法は、ゲル電気泳動を行っています。大変申し訳ないのですが、何卒、教えてください。よろしくお願いします。

回答No.1

noname#17364

こんにちは。
　何がどう上手くいかないのかわかりません。従ってどういうアドバイスが欲しいのかもわかりません。
　もうちょっと補足してみては？