遺伝子をノックダウンして機能解析する方法

質問

機能未知蛋白の機能を調べるために細胞株に過剰発現を試みたのですが大した成果が得られなかったので、今度はRNAiでノックダウンを行ってみました。
その際念のために複数種類のsiRNA(既製品3本)を使ったところ、全てフェノタイプが異なっていて、何がなにやら判らなくなってしまいました。
いわゆるオフターゲット効果という事ではないかと思っています。
しかし、siRNAの濃度を今以上に下げると、肝心のターゲットが抑制されなくなってしまうようで、さてどうしようか困っています。
こういう場合、実験の進め方としては、経験者の皆様ならどのような対処をなさいますか？
RNAiの条件検討に戻るべきか、全く別のアプローチを取るべきか。。
あまり時間もお金も無いので、どうしたものかと思案中です。。。

回答No.5

miya_0726

ANo.3、4です

何度もすみません。
デザイン済みsiRNAでmRNA、タンパクの減少は確認されているということですね。
確かにsiRNAを使用する限り、オフターゲット効果は付いて回る問題ではあるのですが、同一遺伝子に対するデザイン済みsiRNAの3本ともが表現型に影響を及ぼすようなオフターゲット効果を持つというのはちょっと考えにくいところがあります。
他に考えられるところといえば、スプライシングバリアントの存在ですが、標的とする遺伝子にはスプライシングバリアントがありませんか？siRNAは標的mRNAのどこに相補するか見てみましたか？
こういったこともチェックしつつ、他社のsiRNA購入も検討されるのがよろしいかと思います。

お礼

何度もご回答、ありがとうございます。
恐らく現れた表現型のどれかが本物で、その他がオフターゲット？という事なのかもしれないなとは思っているのですが、その鑑別が出来なくて困ってしまいました。本来なら嬉しい事にランダム配列のsiRNA(これもメーカー品ですが)とは明らかに異なる表現を示すのですが。
しかも、この遺伝子にスプライスバリアントは存在しない事になっています。(少なくともデータベース上は。。)。しかも、siRNAが相補する位置は同一エクソン上という事もわかっています。
もっと条件を見直してみようかとも思っているのですが、これほど解釈が難しくなるとは思っていませんでした。
最初は簡単に考えていたのですが、奥が深いです。。。

回答No.4

miya_0726

オフターゲット効果は、siRNAのマイクロRNA的な抑制機構によるものといわれています。通常、siRNAとしての効果はオフターゲット効果よりもはるかに低い濃度で出ると考えられており、単体の濃度を下げることでsiRNAとしての効果のみを残しつつトータルで十分なノックダウン効果を得ることができます。このような考え方で実際に製品にしている会社もあります。

http://www.hssnet.co.jp/2/2_1_4_1.html

ところで、各siRNAを導入した際のmRNA量変化はチェックしましたか？
また、最近ですと標的ノックダウンを保証するsiRNAが多数販売されていますが、そういったものを購入されなかったのでしょうか。

お礼

専門家のご回答、ありがとうございました。

ターゲットのダウンは、mRNA,WBの双方で確認してみました。
いずれもターゲットの抑制程度については80%以上だったので、その時点では十分に効果的と考えていました。

siRNAは自分でデザインした訳ではなく(うまく作れる自信が全然無かったので。。)メーカーがデザイン済み(具体的にはInvitrogenです)のものを購入しました。
一応、メーカーマニュアルの濃度幅の下限に近いところで実験してもノックダウン効率は十分なものだったのですが、何故かフェノタイプが異なるという現象に遭遇し、困惑中です。

カクテルは却ってオフターゲットを誘発するという解説をしている会社もあったので躊躇していたのですが、実際には結構やられている手法なのでしょうか。ご紹介頂いた会社の製品も確認してみます。
ありがとうございました。
また何かありましたらよろしくお願いいたします。

回答No.3

miya_0726

手持ちのsiRNAにこだわるのであれば、カクテルにして使用してみるのも手かと思います。
現在の最も少ない使用量の1/3ずつ混合して使用してみてはいかがでしょうか？
siRNAのオフターゲットに関しては、単純にBLASTやFASTAなどで見つかるものでもないため、配列情報から表現型へ攻めるのは少々危険に感じます。

お礼

アドバイスありがとうございます！
なるほど。そんな手もあるのですね。
でもそれだと、3種のフェノタイプが全部現れてしまうなんて事はないのでしょうか。
siRNAは奥が深いとつくづく感じています。。。

回答No.2

guragura77

RNAi耐性のターゲットタンパク質を発現させて、元に戻るかどうか試してみたらどうですか？　そうすればいわゆるオフターゲット効果をおこすものは除外できるはずです。発現用のコンストラクトがあるならポイントミューテーションを入れるくらいは然程手間は掛からないと思います。真っ当に実験するならノックダウンの後に当然やってしかるべき操作ですしね。

お礼

アドバイスありがとうございます！
なるほど、そういう風に考えるのですね。
参考になりました！！
本当にありがとうございます。

回答No.1

ga111

siRNA以外では、なかなか難しいですね。だからこそ、RNAiが流行しているというのがあると思います。

ターゲットが抑制されている濃度で、フェノタイプに面白いのがあれば、もう３本ほど作っておなじフェノタイプを期待するのが手かもしれません。（保証なし）

NCBI Blastなどにより、元の３本が非特異的にそのフェノタイプを示しそうな産物をノックダウンをしないか？もヒントになるかもしれません。

お礼

ご回答、ありがとうございます。
更に3本ですか。。。お、お金が。。。
Blastはやってみたのですが、残念ながらそれらしきものは見当たらずでした。