RNAi でのノックダウンが確認できません

質問

教えてください。

RNAiを用いた実験を進めていますが、ウェスタンブロット（WB)でのノックダウンの確認が取れずに困っています。というのは、RT-PCTではRNAのノックダウンが確認できているのですが、同様にtransfectionした細胞でWBをすると、RNAiをtransfectionしてノックダウンできているはずのタンパク質の発現が増加しているのです。ちなみに細胞はHUVECで、transfection 48～72時間後にサンプリングを行っています。
抗体の特異性は高いとのことなのですが、RT-PCRで発現が落ちているのにタンパクレベルで発現が上がるという状況にどうやっても説明がつかず、頭を抱えています。
同様の経験があるかた、何か解決方法をご存知のかたがいらっしゃればアドバイスよろしくお願いします。

回答No.4

lamb1204 · ベストアンサー

植物ですので参考になるかわかりませんが・・・
RNAiが恒常的に起こるような形質転換体をたまに作ります。
昨年作製した形質転換体では、
転写産物量は全く減少していないものから20%程度までありました（Realtime RT-PCR）。
一方、イムノブロットしてみると翻訳産物量は、減少しているものも、増加しているように見えるものもありました。
そして、転写産物量と翻訳産物量を比較してみると、逆相関？な関係になっていました。
もしかしたらRNAiと翻訳産物量の調節のあいだには、明らかになっていない機構があるかもしれませんね。

ちなみに、イムノブロットは何をベースにしているのでしょうか？細胞あたりの翻訳産物量が減少したりはしていませんか？

補足

ありがとうございます。

mRNAは減少し、タンパクは増えてる…こういう現象が私以外でもあるということを知れただけでもちょっと救いになりました。

RNAiのfinal濃度を以前の1/10量に減らしてみたところ、タンパク発現の増加はなくなり、ネガコンと同レベルにまでなりました。（減少はしていないので、ノックダウンの確認にはなりませんが…）

論文投稿を行うとして、WBが優先されるという事を依然回答でいただいたのですが、タンパクレベルでのノックダウンが確認できない場合はRT-PCRの結果のみでもいいのでしょうか？？

回答No.5

lamb1204

No4です。

>論文投稿を行うとして、WBが優先されるという事を依然回答でいただいたのですが、タンパクレベルでのノックダウンが確認できない場合はRT-PCRの結果のみでもいいのでしょうか？？

RNAiでなにを言いたいかによります。
目的遺伝子にコードされるタンパク質の機能について調べるのでしたら、タンパク質量が減少していない試料で実験しても意味がありませんよね？雑誌によっては、もしかしたらRT-PCRのデータだけでも通っちゃうかもしれませんが、それで議論しても嘘になってしまいます。
逆にRNAiによるmRNAの分解という現象自体を議論されるのでしたら、mRNAだけ見てもかまわない場合のほうが多いように思います。

回答No.3

yakyutuku

似たような遺伝子が複数あって、そっちの発現が上がってたりして。

回答No.2

rio2

ウェスタンブロットに問題がないとすれば、単純に発現しているタンパク質の細胞内外での滞留時間の問題（48～72時間では消化しきれていない？）ではないでしょうか？
ウェスタンブロットに問題があるとすれば、細胞内での量についてはFACSなどを用いる手もあります。SPRやQCMのような方法もありますね。
あるいは、標的mRNA以外の部分でフィードバックがかかっているというシナリオで探索できないでしょうか？
以前RNAiやアンチセンス用のキャリアー試薬の作成していたことがあって、大変興味深い現象に思います。

お礼

フィードバックがかかっているとしたら、おもしろい事だと思います。RNAiのフィードバック機構が解明できれば…とも思ったりもしますが、大きく道がずれてしまうなぁ～(^^;

とりあえず考えれるだけの事をやってみます。
ありがとうございました！

回答No.1

ga111

一般には、WBのデータが優先されます。RT-PCRはｍRNAのレベルで測るからで、より間接的な証拠になります。

蛋白の代謝が遅いか安定な場合、複雑な制御によって蛋白レベルが例外的に上がることは可能性は低いですがあるかもしれません。

いずれにせよ、ポジティブコントロールを（別のターゲット、別のRNAi、別の抗体）とって自分の系がちゃんと動いているかどうかをみてください。また、RNAiの技法自体が向かない（いろいろ別な部分を狙ってもどうしてもうまく行かない）場合も例外的にあるようです。