タンパク抽出

質問

酵母からタンパク質を抽出する方法を教えてください。ちなみに、発現量を見たいだけなので、変性とかはしてもかまいません。

回答No.2

narupon · ベストアンサー

それは酵母宿主でベクターに組み込んだ目的タンパクを発現させたってことでいいんですかね？
抽出と書かれているので、細胞外発現系でもないんですよね？

となると、
ポジコン酵母（インサートなしのベクター導入済）と組換え酵母を同様に培養し、超音波破砕・フレンチプレスなどで破砕。
得られたサンプルをSDS-PAGEで解析。
両者のバンドの濃さを比較。
ぐらいでしょうか。

補足

ありがとうございます。超音波のみで細胞壁も破砕されるのですか？それとも両方で処理する必要があるのでしょうか？何か参考になるサイトなどありましたら併せて教えて頂けますでしょうか？

回答No.3

narupon

＃２です。

どちらか一方で大丈夫です。
大抵は超音波で破砕します。

１：培養後、適当なバッファーor生理食塩水で洗浄（培地成分・細胞外発現タンパクなどの夾雑物を取り除くため）。
２：バッファー等に懸濁し、超音波破砕。
３：最初白濁状態だったものが、だんだん透明＆ドロドロになってきたらちゃんと破砕されている証拠。終了。

（注意）氷冷しながら操作してください。超音波破砕操作で温度も上昇しますし、常温などではプロテアーゼ等が活性化されて、目的タンパクを分解してしまう可能性があります。
サンプル温度が上がってきたら冷えるまで氷冷してください。
（30sec破砕→30sec氷冷の繰り返しとか）

お礼

参考になりました。ありがとうございました。

回答No.1

jacknorantan

簡単に説明しておきます。
１．大腸菌を培養する。
２．それを集菌し、細胞を破壊する。
抽出方法はこんあもんでしょうか。
発現確認は、SDS-PAGEを用いて確認できます。

お礼

ご回答どうもありがとうございました。