タンパク質の変性と巻き戻しについて

質問

大腸菌を用いて15k程度のタンパク質を発現させてるんですが、ほとんど不溶画分にいってしまい、現在は変性剤等を用いて可溶化を試みています（低温培養、アルギニンの導入はダメでした）

そこで初歩的な質問なんですが、
1、変性剤を用いるとタグまで変性してしまうのでしょうか？また、タグが変性してしまった場合、樹脂には吸着しないものなんでしょうか？（使っているタグはGSTです）

2、変性剤でタンパク質をグチャグチャにし、その後変性剤を取り除き、タンパク質を巻き戻すことで可溶化させるという手法において、どの段階で可溶化が起きているのかがわかりません
「タンパク質が正しい構造をとった状態（refolding）＝可溶化した状態」ということなのでしょうか？それとも変性した段階で可溶化が起っているのでしょうか？

よろしくお願いします。

回答No.2

Chicago243 · ベストアンサー

GSTは変性させるとだめですね。一度変性させて、refolding後に精製するという方法もやられているようですが、GSTでうまくいくプロトコールがあるか分かりません。

http://www.cosmobio.co.jp/technical/tech_NVG_20040518/tech_NVG-8-B_20040518.asp
http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/tb234.pdf

タンパク質の可溶化というのはタンパクの変性と直接関係ありません。たんぱく質が水溶液に溶けたかかどうかです。変性はたんぱく質が従来の構造を失い、失活した状態です。
たんぱく質が水溶液に溶けない理由はいろいろありますが、表面に露出している疎水せいの部分がくっつきアグリゲーションが起こるなどの理由が考えられます。したがって可溶化するために疎水結合を切る試薬をよく使います。このような試薬はたんぱく質の構造を支えているタンパク質分子内の疎水結合も切ってしまうことがあります。そうするとたんぱく質は変性した状態にならざるおえません。可溶化にともない変性することがあるということです。
refoldingはこのような壊れた構造を本に戻す作業です。このこと自体も可溶化に直接関係ないということが分かってもらえたと思います。

お礼

わかりやすい説明ありがとうございます。
変性剤の目的はタンパク質の変性を起こすことでなく、凝集の原因である疎水性結合を切ることで可溶化させているんですね。
どうもありがとうございました！

回答No.3

geneticist12

1. ファルマシアの説明書には一応、2-3 M のグアニジン塩酸や尿素、2％のTx-100、1%のCTAB、10 mM DTT、0.03%SDSの存在下の変性条件でも、GST融合タンパク質をグルタチオン-S-Sephroseゲルでアフィニティー精製しうる（成功例がある）とあります。そういう条件下でも吸着するかどうかはケースバイケースでしょうけれど。

私は、GSTとMBPの融合タンパク質で不溶化したものを、メーカーが許容範囲といっている変性条件でアフィニティー精製したことがありましたが、うまくいった試しがないです。

2. 大腸菌で発現したタンパク質が不溶化するのはinclusion body、封入体を形成するからです。これは、大量発現した外因性のタンパク質が、めちゃくちゃに折り畳まれて不溶性のかたまりにまとめられたものです。そうやって、タンパク質を不溶性、不活性の状態にすることで細胞を保護する一種の防御反応とも言えるでしょう。

封入体を変性剤で処理すると、折り畳みや凝集が解除されて可溶化します。しかし、変性状態なので正常な折り畳み構造はできず、多くの場合活性もありません。

これから、適当な条件で変性剤を除くとか、シャペロニンを加えるとかすると、正常な折り畳み構造が出来る場合があるのです。天然状態のタンパク質は、ふつう細胞内で可溶性ですから、正常な折り畳み構造を持ったタンパク質は可溶性である可能性が高いのです。

お礼

あまり高い濃度の変性剤ではアフィニティー精製できなのですね。

＞天然状態のタンパク質は、ふつう細胞内で可溶性ですから、正常な折り畳み構造を持ったタンパク質は可溶性である可能性が高いのです

つまり、変性剤を取り除き、かつ可溶化していれば正常な構造をとっている可能性が高いというこですね。

勉強になりました。ありがとうございました！

回答No.1

pi3-kinase

GSTタグは変性条件下では、樹脂吸着能がなくなると思いますよ。Hisタグだったら、変性条件下でもいけたと思います。ちなみに誘導剤(IPTG)を低濃度にしたりとかはしました？タグをMBPタグに変えるとインクルージョンボディに行かなくなったことがあります。お試しあれ！

お礼

GSTタグの場合は変性すると吸着しなくなるのですね・・。
IPTGの濃度を下げた事はありませんでした。さっそくやってみます！
MBPタグに変えるのは上の人に相談してみます！
ありがとうございました！