限外ろ過について

質問

現在タンパクの実験を行っています。
血清サンプルなのでSDS-PAGE時にアルブミンの影響なのか、レーンが曲がってしまいます。
ただ、標的タンパクが巨大分子なので、アルブミンは流しきっているのですが、この場合、限外ろ過などの方法でアルブミンをろ過することで問題点は解決するでしょうか？

また、ろ過するときには血清のみがよいのか、何かバッファーを入れたほうがいいのかお教え願えますと助かります。

よろしくお願いいたします。

回答No.2

Chicago243 · ベストアンサー

たしかにアルブミンは血清中に大量にあってえいどうの邪魔することが多いです。

http://www.millipore.com/userguides.nsf/docs/p36449
こんなキットがあります。

あと100kDa以上のポアサイズでフィルターをすればアルブミンは多分膜を通過して落ちてくるでしょうから目的にものがポアサイズ以上なら分けることができるでしょう。
http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C3036
http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C7715

ろ過の時は希釈することになると思います。そのまま濾過しても何とかなると思いますが、希釈した方が無難ですね。どれくらい減らせばいいかによりますが、濾過しボリュームが減ってきたらまたバッファーをつぎたしてと何回かしないといけないかもしれません。

お礼

回答、ありがとうございます。参考のキットも視野に入れていろいろと検討してみます！
ありがとうございました！

回答No.1

gori8063

レーンが曲がるのは試料だけの問題でもない気がしますが、他のタンパク質の泳動ではきれいに行くのでしょうか？
ゲルは自作ですか？　泳動槽は最近のモノですか？

プレキャストゲルを用いることで改善する可能性もあります。

また、確かに血漿試料をそのまま流すとなるとタンパク質のローディング量として適切なのかということになってきます。アルブミン・グロブリンはかなりの量入っていますから、限外ろ過で改善の余地もあるかと思います。

血漿＋PBSなどで薄めたほうがろ過の速度は速いかと思います。

お礼

回答、ありがとうございます。
ゲルは自作、泳動槽も少し古めです。細胞のタンパクなどだとレーンも曲がらずにいくのですが。。。
PBSで希釈、ありがとうございました！