ゲルろ過とＳＤＳ

質問

ゲルろ過クロマトグラフィーを用いたたんぱく質の分離とＳＤＳ－ＰＡＧＥの実験を行ったのですが、
その実験で、ＳＤＳの染色像を見て疑問に思ったことがあったので、投稿させて頂きました。

・卵白アルブミンとヘモグロビンの混合溶液をゲルろ過し、得たサンプル７本と、アルブミンのみとヘモグロビンのみのサンプルと分子量マーカーの計１０本を流したのですが、ゲルろ過したサンプルのうち４本はヘモグロビンのみのサンプルと同じ位置にでたのですが、残り３本にはまったく染色像が現れなかったのです。
これは、なぜなのでしょうか？
もちろんアルブミンのみのサンプルは染色像がしっかりとでていまし、マーカーより得られた分子量も文献値と近かったです。
混合溶液のアルブミン量が少なすぎたからなのでしょうか？
他の染色像はしっかりしているので、そこだけ染色がうまくいってないと思うのは少しおかしいとも思うので、、、
何が原因なのでしょうか？

・また、ヘモグロビンの染色像が現れた場所が文献値のヘモグロビンの分子量から考えられる場所と違ったのは、やはり、ＳＤＳより変性を受けヘモグロビンの立体構造が壊れたことによって４量体を形成してないからと考えてよいのでしょうか？
さらには、染色像が何個も？あるように見えるのですが、それは、４個のサブユニットが部分的に切れてしまって様々な分子量のヘモグロビンができたと考えてよいのでしょうか？

長々と質問させてもらいまして、すみませんでした。
レポートの考察段階で困ってしまいました。教えていただけるとうれしいです。よろしくお願いします。

回答No.1

mizu_atsu · ベストアンサー

実験の詳細がわからないのでなんとも言えませんが

＞４本はヘモグロビンのみのサンプルと同じ位置にでたのですが、残り３本にはまったく染色像が現れなかったのです。

単になにもない（もしくは非常に薄い）画分を採ってしまったのでは？
サンプリングのタイミングがずれていたとかかな。
学生実験のようですから原液の濃度は適切なものであったと思います。
自分で調整したとしたら調整ミスで薄かったということもあるかもしれません。

＞染色像が何個も？あるように見えるのですが、それは、４個のサブユニットが部分的に切れてしまって様々な分子量のヘモグロビンができたと考えてよいのでしょうか？

変性処理が適切に行われている限りバラバラになっているはずです。
2量体や3量体にはならないはずです。

ちなみに他の班の結果はどうですか？
それらと見比べて違う部分が見つかれば
原因もわかるかもしれません。

お礼

ありがとうございます。
実は、少し勘違いをしてることがわかりまして。。
でも、大変参考になりました。

回答No.2

osarut

ゲルろ過、ということは分子量の違いでタンパクを分離・精製しているはずです。
ので、得られたサンプル全てに目的タンパクが入っていなくても不思議なことではありませんよ。
恐らく実験では、ゲルろ過の原理などを勉強することを目的としているのではないかと考えられます。

あと、SDS-PAGEを行なう際には通常、還元剤としてメルカプトエタノールを添加し、さらに熱処理（100℃、5分程度）を行なっているはずです。
ですので、タンパクの立体構造は保持されず、4量体のタンパクのそれぞれのサブユニットのところにバンドが出るのではないでしょうか。

立体構造などを保持したまま、というのであればNative-PAGEと呼ばれる手法を用いることが多いです。

お礼

ありがとうございました。
参考になりました。