pBluescriptファージミドについて

質問

お世話になります。
クローニング後、In vivo Excisionで、pBluescriptをSOLRに感染させた場合、この生えてきたコロニー内の大腸菌は溶菌されているのでしょうか（プラークとなっている？）。
また、ファージの分類（ビルレント・テンペレートファージ区分）の表など、記載してあるものがありましたら教えてください。よろしくお願いします。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

いわゆるcolony PCRという方法で良いと思います。

コロニーをつついてreaction mixに入れて、95℃位で10分処理（この間にplasmidが溶出）、酵素を加えてPCRです。

最初から酵素を含んだreaction mixに入れて、いきなりPCRでも結構いけます。

いろいろなprotocolがあると思いますがcolony PCRをキーワードに探してみてください。

回答No.1

geneticist12

溶菌しません。

excisionのときにco-infectするhelper phage (ExAssist)は、Amber mutaionを持っています。Amber suppressorを持たないSOLRの中では増殖せずphageを生じません。したがって、pBlueScriptがプラスミドフォームとしてのみ増殖します。

また、excisionの前に感染させたlambda phageは、切り出しの後、熱で不活性化を加えるので、SOLRに感染して溶菌することはありません。

in vivo excisionで生じるファージはM13系だったと思います。環状一本鎖DNAを含む繊維状ファージです。このタイプのファージはF繊毛を標的に感染し、Replication form (RF)、つまりプラスミドとして増殖、子ファージは菌体から分泌されるように放出されるので大腸菌がいきなり溶菌するようなことはありません。しかしながら、プレートに蒔くとプラークは確認できます（lambdaのように透明ではないです）。

お礼

早速のお答え、ありがとうございました。そこで重ねて質問させて頂きたいのですが、溶菌しないのであれば、クローニング後のInsert cDNA確認のためのＰＣＲを行う場合は、どのようにしたらいいのでしょうか？お恥ずかしい質問で大変申し訳ありませんが、よろしくお願いします。