Long PCRのこつ

質問

現在、TakaraのLA Taqを用いて、20kb位の増幅を試みています。参考書などには、30kbは余裕で増えるようなことが書いてありました。簡単に増幅するのは、10kbくらいなのでしょうか？長いフラグメントを増幅するこつがあれば、教えて頂きたいです。現段階では、増幅に成功していないのですが、腕が悪いのか、プライマーが悪いのか、酵素の限界なのか分からないので、アドバイスよろしくお願い致します。

回答No.1

blackdragon

・長めのプライマーを使う（GC高すぎない30-35b程度）
・良質なテンプレートを用意する
　（断片化させないような調製法、取扱い）
・テンプレートを多めに使う
・反応液をon iceで調製し、加熱済みのPCR装置にセットする

といった辺りが一般的なこつでしょうね。
下記参考URLのページの下の方の各種プロトコールやアプリケーションに目を通してみるといいと思います。

参考URL：

http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0179

お礼

回答、ありがとうございました。

一応、TAKARAのトラブルシューティングを見て、やっていますが、うまくいきません。

加熱済みのPCR装置など、細かいところに気を付けながら、再度やってみます。