PCR結果の考察

質問

こんにちは。経験、知識の少ない私に、貴重なアドバイスを頂きたくて質問します。

ヘモバルトネラ（マイコプラズマ）というリケッチアの感染を調べるため、PCRを行いました
ここで、使用したプライマーについて説明します
ヘモバルには、California(CA),Ohio(OH) という２つの株があります
ヘモバルを研究者した人が2人いたので、プライマーはそれぞれH１、H２　があります
H１　は、Reverse（OH,CA 共通）とCA,OH のそれぞれのプライマーで行います
H2 は、Forward（OH,CA 共通）とCA,OH のそれぞれのプライマーで行いますが、この場合、CA,OH のそれぞれのプライマーは１塩基のみの違いです。
だから、ヘモバル陽性ならH２ではOH,CA の両方にバンドがでます

そこで、本題なのですが、今回の検査結果ではH１のOH,CA は陰性（バンドが出ず）で、H２のOH,CA は陽性でした。このバンドの位置は両方ともOHのバンドの位置（両者で２０塩基の差があります）だったのですがこの結果は　『OH 陽性』となるのでしょうか？

あと、PCRのポジコンにはOH,CA の両方に感染した検体のDNA抽出物を使っているのですが、H１のOH,CA では正しい位置にバンドが出て（OHはかなりバンドが薄いです）、H２ではOH,CA ともにCAの位置にバンドが出ます
この結果の理由として、OHの感染率が高く,CAの感染率が低かったのではないかと解析しているのですが、、、どうなのでしょうか？？？

長くややこしい質問で申し訳ないのですが　回答よろしくお願いします

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

PCRは原理が簡単で誰でも手を出しやすいので、いつでもだれでもうまくいくと思われがちですが、実はかなりトリッキーです。文献を参考にした実験にしても、実験者、設備、器具、試薬などが異なればそのまま再現できるとは限りません。まず、自分の系でうまく働くかどうか検討してから、本実験をすべきでしょう。

まず、
＞、PCRのポジコンにはOH,CA の両方に感染した検体のDNA抽出物を使っているのですが、

これは、それぞれ片方のみの検体で、マッチするプライマーではポジティブで、ミスマッチだとネガティブだということをまず確認すべきでしょう。あなたの系ではこれがうまくいっていない可能性が高いのではないかと思います。

3'末端の一塩基が異なるプライマーでタイピングするのは特にトリッキーです。
・合成されたプライマーは信用できる品質か？　低品質のものでは、塩基の欠失や置換が受け入れがたいレベルであることも。また、保存中に3'末端が分解していたりするとタイプ特異性が失われます。
・合成酵素は校正活性のないものを使っているか（ストレートなTaqなど）。校正活性はプライマーの3'ミスマッチを削ってしまうので、タイプの異なるターゲットも増幅されてきます。おなじ理由で、反応系にExonucleaseがコンタミしていても問題です。

補足

回答ありがとうございます
＞PCRは原理が簡単で誰でも手を出しやすいので、いつでもだれでもうまくいくと思われがちですが、実はかなりトリッキーです

＞それぞれ片方のみの検体で、マッチするプライマーではポジティブで、ミスマッチだとネガティブだということをまず確認すべきでしょう。あなたの系ではこれがうまくいっていない可能性が高いのではないかと思います。

まさしくそう思います
先輩が、文献を参考にして作り上げたヘモバルの検査体系なのですが、もう一度考え直さなければいけないと思います

また、プライマーについて、そのようなトラブルシューティングがあるのですね。
本当に大変参考になりました。
いろいろふまえたうえで、プライマー、ポジコン、サイクラーの条件を調べなおして試ます
アドバイスありがとうございました

回答No.4

babanbabanbanban

ちなみにH1のOHプライマーはCA株も引っ掛けたりしませんでしょうか？その薄いバンドもシーケンスしておくのはどうですか？

とりあえずOHのポジティブコントロールが欲しいですね。ポジコンで検出できて、ネガコンで検出できない条件を見つけて、それからサンプルに移行。

これが一番の近道だと思います。
どんなプライマーも条件をゆるくすれば似たような配列をガンガン増やすようですし。

お礼

>ちなみにH1のOHプライマーはCA株も引っ掛けたりしませんでしょうか？

まさしくその通りで、引っかかってきました
今までCA、OHの両方に感染していたと思ってポジコンとして使っていたものがCAのみ感染したものだったんですが、それがH1のOHプライマーでうっすらばんどがでました。

シークエンスでCA、OHのサンプルは決定できたので、これからは条件にあったプライマーを作成しなおそうと思います

アドバイス有難うございました

回答No.2

babanbabanbanban

ポジコンでOHが薄いということから、H1のOHプライマーもしくはReverseプライマーが、Ohio株の検出に相当不適なんではないでしょうか？

もしくはOhio株が、日本で変異しているのかも。

今後の方針としては以下が思いつきます。

１．PCR産物の塩基配列を決定する。
２．H2のプライマーを報告した論文が信用できるものか確かめる。

お礼

回答ありがとうございます

＞ポジコンでOHが薄いということから、H1のOHプライマーもしくはReverseプライマーが、Ohio株の検出に相当不適なんではないでしょうか？

そのとおりですね
今回、シークエンスの結果サンプルがOH感染していたことが判明しました
あと、ポジコンで使っていたものがCAにだけしか感染していなかった可能性がでてきて（ポジコンはシークエンスしていないので）そう考えたら納得できるのです

どちらにしても、今回のサンプルがH1ではバンドが出ていないので、考えているのですが、、、
H2は３回PCRをやり直していて、H1は1回だけなのでもう一度、やり直してみようと思います
サイクラーの条件が悪いのですかね？プライマーにも不適とかあるのですね。知りませんでした。

回答No.1

MIYD

サンプルの濃度や精製方法に問題がないという前提でアドバイスすると、
サンプルかプライマーを入れ間違えているのではないでしょうか。

ポジコンは、CA,OHのどちらかだけに感染している検体両方
(と感染していない検体(ネガコン))
を使って、
プライマーと検体が違う組み合わせの時には走らない条件にしておかないと、
非特異的に増幅しているものを見ている可能性が残ります。

ポジコンでH1-OHのバンドが薄いのであれば、
サンプルのH1-OHが見えていないのは増えにくいために
見えていないという可能性があります。
そのため、H2-OHで目的のバンドがあるので
学生実習レベルであれば、OHに感染しているとはいえると思います。
(結果を外に出すのであれば、条件を変えてやり直す必要があると思いますが)

H2-CAでOHのバンドが出ていることはCAが感染している証明にはなりません。
H1-CAで陰性ですし。
どちらかというと１塩基しか違わないプライマーがOHの配列にくっついている可能性のほうが高いのではないでしょうか。
(コントロールを用意していないのでそれを否定することが出来ません。
感染しているコピー数を問題にするのならばどちらも高コピーでも、もう片方は増えないというデータが必要になると思います)

サンプル：H2-CA,H2-OH→OHのバンドのみ
ポジコン:H2-CA,H2-OH→CAのバンドのみ
という結果はPCR時にプライマーを入れ間違えているか、
電気泳動するときに載せ間違えているような気がします。

ポジコンがうまくいっていない以上
やり直すのが一番早いと思いますが、

CA,OHのプライマーが1塩基しか変わらないのに、
目的のバンドが20bpも違うというのであれば、
その20bp部分を含むプライマーを設計して、
片方だけしか増えないプライマーの組み合わせを作ることは出来ないのでしょうか。

お礼

いつも丁寧な回答ありがとうございます

＞サンプルかプライマーを入れ間違えているのではないでしょうか

PCR、電気泳動は３回くらいやり直していて、同じ結果なので間違いはないはずです

そして、今回の検体のシークエンス（H2のCAとOHのサンプルで）をおこなって今結果が出たのですがどちらもOHということが判明しました！

その結果をふまえて考えるとポジコンはCA,OHの両方に感染していると聞いたのですが、実はCAにしか感染していなかったのではないかと思うのです、、、
H1でOHのポジコンのバンドが出るのは非特異的に増幅しているものだと考えれば納得できるのです
そして、もちろんH2のOHのプライマーでも・・・

ですが、今回はOHに感染しているのにH1のOHのプライマーではバンドが出なかったのでもう一度サイクラーの条件を考えなければいけないですね

学年が変わって、先輩からこのヘモバル検査をひきついだのですが、先輩は文献を参考にしこの検査体系をつくったらしいのです。
このような結果が出る以上、やはりアドバイスどおり検査体系を見直し、プライマーについても作り直してみようと思います

ありがとうございました