制限酵素のユニット計算について

質問

・１U＝１μｇ;のλDNA(48000bp)を一時間に完全分解する酵素量
・λDNAはEcoR1で5か所切断できる

を前提に
pbluescript(3000bp)１μｇ分をEcoR1で一か所切るのに必要な酵素量は？という問いに対する答えが
（48000/3000）×（1/5）＝3U
となっていますが、、なぜ48000を3000で割るのでしょうか？
通常の比の式で考えると3000／48000になるのでは？？

勉強不足ですみません；調べてもよくわからなかったのでどなたか解説していただきたいです。

回答No.2

Mr_Spock

出題者は、分子数（モル数）あたりで換算する必要があると考えて、同じ1 ugでも、3 kbのDNAは48 kbのDNA（単位定義基質のlambda DNA)より48/3=16倍、分子数（モル数）が多いという計算をしているんでしょう。

しかーし、出題者の考え方は間違っていると思うよ。実践上役に立たない考え方である上に、根本的に間違っていることを教えている疑いが濃厚（名人だか達人だとかおだてられて、どこかのメーカーのお抱えの先生書いている、かなり怪しい手引き書にもそんなことが書いてあったけれど、そんなのを情報源しているとしたら、ダメダメです）。どういう根拠、どういう考え方で計算しているのか、あるいは根拠となる文献はなにか、質問して厳しく追及した方がいいかも。

どういうところが間違っているかというと、
その考えでいくと、おなじ3 kbのプラスミドでもEcoRIが1箇所しかないものと10箇所あるものでは、同じ条件で完全消化しようとするときに必要な酵素は、後者の方が前者の10倍必要ということになりますが、そんなこたあありません。同じ酵素量で切れます。

反応速度論から借りてきて、切断配列のモル数が増えれば、それに比例して酵素量や反応時間が余計にかかるとでも言うのでしょうが、それは違うでしょう。
制限酵素消化が基質も酵素も濃度が中庸なので、反応速度が一次反応の範囲だとすれば、基質濃度が倍になった時に反応速度（例えば一秒で何回切断が起こるか）が倍になるので、完全消化にかかる時間が倍になるわけではないですね。まして、DNAのような巨大分子上にある個々の切断配列の個数を、単純に基質分子の数として考えるのも、それを濃度として考えるのも無理があります。むしろ反応系にあるDNA分子の総延長（これはサイズがちがっても同じ重量のDNAなら一致します）が基質で、基質上を制限酵素は基質上を走査して切断配列に当たったら切る、1 unitは1 ugのDNAを一時間でくまなく走査するのに必要な酵素量（くまなく走査しているので見落とされ切断されなかった認識配列はない、これがすなわち完全消化）というようなイメージの方があたっていると思います。

お礼

なるほど～分子量で考えてるわけですね。
そう考えると納得ですね!!

詳しい回答をしてくださってありがとうございます。
参考にさせていただきます。

回答No.1

Dr_Hyper

通常の比の式はどうやってたてたのでしょうか？

私が思う簡単な計算方法としては
1ug/48000bp : 1ug /3000 bp = 1 unit : x unit
でxを計算して、16になります。
さらにλのほうは5箇所切断するので、pBSに必要なのは、その1/5ですよね。簡単にいうと1ugをbpで割ることでplasmidの数を計算していますよね。

お礼

わかりました!!

丁寧なご説明ありがとうございます。参考にさせていただきます。