プラスミドの大量調製

質問

題字の如くなのですが、プラスミドの大量調製が思いのほかうまくいきません。培養の際の培地を500mlないし1lで大腸菌を増やしているのですが、大腸菌自体はばかばか増えるのに、そこから得られるプラスミドが10μgくらいしかありません。low-copy plasmidかとも疑い、培地の量をかえてトライもしてみましたが、こちらでもうまくいかないんです。
培地には抗生物質を添加しているので、プラスミドを持たない大腸菌が急増するということは考えにくいですし、やはり細胞内でのコピー数が少ないと考えています。
このようなプラスミドの収量を上げるには、どうすれば良いでしょうか？具体的な数字で表すと、100μgは取れるといいのですが。
何か工夫すべき点がありましたら、ご教授願います。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

まず、プラスミドの骨格は何でしょうか。
low-copyかどうかは普通は疑うのではなく調べるものです。
プラスミドのoriが何由来なのかを調べれば大体のコピー数と収量がわかります。
http://www.promega.co.jp/cat/technical/17-q.html
P1　phage由来のPACベクターに大きいインサートが入っていれば1l培養しても10ugしか取れないということはあります。

それと、1mlで培養した時にはどのくらい取れるのでしょうか。
たいてい少量のスケールで精製したもののほうがml当たりの収量はいいです。
大量培養した時にもそこから1mlとってちゃんと増えていることを確認したほうがいいかとおもいます。

実際の大量調整の時にはどの方法を使ってどのスケールでやっているのでしょうか。
アルカリSDS法かその変法のキットを使っていると思いますが、
ちゃんとリシスしているのか誰かわかる人に確認してもらったほうがいいと思います。
大腸菌が壊れていなければプラスミドは出てこないでペレットとして捨てられることになります。

抗生物質の濃度は適当なのでしょうか。場合によっては2倍くらいにしたほうが収量がよくなることがあります。

もしかりにlow-copyのプラスミドならば
途中でクロラムフェニコールを加えることにより大腸菌の増殖を止めてコピー数を増やすことができることがありますが、
コピー数が少ないプラスミドをわざわざ使っている時には、コピー数が増えると組換えを起こすようなインサートが入っていることがあるので
事前に調べておく必要があります。

補足

使用しているプラスミドはpact5Cという全長約6kbのもので、そこに小さい場合は約2kb、大きい場合は約5kbのインサートを組み込んでいます。
通常のスモールスケールは3mlの系で行い、大体1μl当たり0.5μgから1μgくらいの収量があります。
大量培養の際も、スモールスケールの場合も同じQIAGENのplasmid kitを使用しています。スモールスケールの場合はmini kit、大量培養の際はmaxi kitを用います。抗生物質の濃度は、50μg/mlで統一しています。

回答No.4

geneticist12

＞スモールスケールの場合、大腸菌液3mlの系で1μl当たり0.5μgから1μg位の収量になります。
なので、40～50本やれば100μgは取れると思います。

では、ごく当たり前の収量ですね。

ということは、比例的にスケールアップできていないということですね。多分、培養条件が不適切なのだと思います。

ラージスケールで12～16時間培養というのも長すぎるのではないでしょうか。教科書的には、6から8時間で、プラスミド精製にもって行けるようにしたほうが良いように思います（たとえば、朝からboostをはじめて夕方収穫する）。たとえmaxまで殖えて定常状態になっていなくても、その辺でとめておいたほうが良いと思います。

500～1000 mLの培養に、種が100 uLというのは少なすぎるような。ふつう、定常状態までふやした培養液を、1/100から少なくとも1/1000の体積で加えますが。

それで改善しないようだったら、私は、3 mL培養を4、50本やって、それをプールしてプラスミド精製するほうが現実的だと思います。

お礼

細胞溶解がうまくいっていないことが判明したため、ここを改善したところ、200μg程度の収量を得ることができました。
培養条件については、普段あまり考えずに培養を行ってしまっているので、もう一度培養条件がそれぞれ適切かどうか検討してみます。
いつも丁寧なアドバイス、ありがとうございます。

回答No.3

geneticist12

small scaleでは充分に取れてますか？
もしそうなら、small scaleで20～30本やれば100 ugくらい取れるのでは？

培養時間が長くなると死ぬ菌が出てきたり、抗生物質が分解されてきてプラスミドをもっていない菌が増えてきたりして、見かけの菌の増え具合とプラスミドの収量が一致しないことがあります。large scaleの場合、短時間で増やすため、2段階、3段階でboostしてやる必要がありますが、その辺の配慮は？

補足

スモールスケールの場合、大腸菌液3mlの系で1μl当たり0.5μgから1μg位の収量になります。
なので、40～50本やれば100μgは取れると思います。
大量培養の場合、培養時間は12～16時間に設定しており、抗生物質添加済み培地100mlに対し、あらかじめスモールスケール(3ml)で培養した菌液のうち100μlを加えています。あとは、上記の時間になるまで振盪培養装置にかけておきます。
従って、２段階、３段階でのboostはやっていないことになるかと思います。

回答No.2

MIYD

追加で、
もしあなたの操作にまったく問題がなく、1l当たり10ugしか取れないプラスミドなのでしたら、
10l以上増やして
(一度には増やせないでしょうから少しずつ培養してアルカリSDS法でイソプロ沈のペレットの状態にしてためておいて)
超遠心で精製するときれいなプラスミドが取れます。
前にPAC、BACを扱っていた時には8l位そうしていました。

もちろんそれほどきれいなプラスミドが必要でないのでしたら全部まとめてフェノクロ、エタ沈でもいいのですが。

あなたの操作に問題がなくても、
共通で使っている抗生物質が濃度が間違っていたり、
誰かが日なたに数日おいていたりして効かない可能性もあります。
新しく抗生物質を作って試したことはありますか。

お礼

抗生物質を新しく作り直して、試したことはありませんが、その後細胞溶解の時点で細胞がうまく溶解していなかったことが判明しました。
改善したところ、200μg程度の収量を得ることができました。
いろいろなアドバイスをありがとうございました。