大腸菌の蘇生培養

質問

大腸菌のシングルコロニーをピックアップして、LB培地に抗生物質を加えた液体培地中で培養しているのですが、一向に増える気配がありません。
そこで、大腸菌がVNC状態になっている可能性があるのではないかと思い、蘇生培養を試そうとしたのですが、その方法が分かりません。
どなたか大腸菌の蘇生培養法を知っていらっしゃる方がおられましたら、是非ともご教授下さい。
どんな些細な情報でも歓迎致します。

回答No.3

MIYD · ベストアンサー

もしプレート上でカリカリになっていて
プレート上に撒いても生えないのでしたら、
そのカリカリな部分を集めてフェノクロ抽出を行い
トランスフォーメーションを行うと回収できる場合があります。
同様にグリセロールストックからもプラスミドを回収して入れなおせば
また形質転換株が得られると思います。

こんなことをするのは
前に回収したプラスミドを使い切って
どうしようもない場合だけでしょうが。

お礼

なるほど、フェノクロでプラスミドを回収してやれば同じ形質転換株が得られるわけですね。
グリセロールストックからもやって見たいと思います。アドバイス、どうもありがとうございました。

回答No.2

blackdragon

大腸菌は、プレート上で長期放置したものですか？

そのような場合、もう一度プレート上にシングルコロニーアイソレーションしなおしてみるのもいいかもしれません。

そうでないなら、むしろ、プレートが古くて、抗生物質が失活していて、プラスミドを持たないクローンがコロニーを形成してしまっていたということの方がありそうです。
もしくは、プレート上ではようやくコロニーを形成できる程度の突然変異による耐性獲得株という可能性も。

（普通の実験室株の大腸菌が、そう簡単にViable but nonculturableになるとは考えにくいです。）

お礼

確かにおっしゃる通り、この大腸菌は２ヶ月前にプレートに播種したものでした。大腸菌が死んでしまっている可能性がありますね。もう一度、シングルコロニーを単離してみます。
ご助言ありがとうございました。

回答No.1

vanial

その大腸菌の保存条件、培養条件はどのようなものでしょうか。

補足

アンピシリンを含むLBプレートに播種したものを４℃で保存しています。乾燥しないように、パラフィルムで目貼りしてあります。このプレートから、シングルコロニーをピックアップして、LB bufferにアンピシリンを加えた液体培地中で３７℃で一晩培養してみました。ところが、翌日になっても培養液に濁りが全く見られず、遠心しても菌体のぺレットができないのです。
ちなみに、この大腸菌のグリセロールストックからも同様の条件で、震盪培養をしてみたのですが、こちらも駄目でした。