脂質の分画

質問

現在ケイ酸カラムクロマトグラフィーで脂質の分画を行っています。そこで質問(1)長い事溶剤を流しているので一回終わるのに3日間くらいかかってしまいます。フラクションコレクターなどなくて全部手でやっているので夜の間はコックをしめて止めておいています。途中で流すのを止めてしまっても大丈夫なのでしょうか？　(2)クロロホルム、アセトン、メタノールの順に流しているのですが、溶剤の境目（クロロホルムからメタノールにかえるとこなど）はとらないほうが良いのですよね？何せ手作業なもので、本当は何ｍｌずつとって測る（脂肪酸の測定をしています）方がいいと思うのですが、含有脂肪酸が少ないため、何ｍｌずつ分けてとっていたら分析に用いれるだけの脂質が量とれません。なのでやはり境目の部分だけ避けてとるのが良いかと思っているのですが・・・。アドバイスお願いいたします。

回答No.2

noname#160321 · ベストアンサー

はい、追加質問はいつでも歓迎。
「本」に書いてあったシリカゲル量はどれ程でしょうか。またyukiyuki56様が初めに「カラムに入れた試料の量」とシリカゲルの量の比は、本に書いてあった例の比と比べてどれ程でしょうか。

シリカゲルの再使用ですが、通常「オープンカラム」と呼ばれるガラスのカラムでの溶媒自然落下の場合は再使用しません。カラムクロマトの場合固定相上の「吸着水の量」が変わると「再現性」が無くなるので、再現性を確保するために新しいシリカゲルを使うのです。
普通再利用する場合、三百度程度まで加熱できるオーブンで「焼き切って」それから「既知量の水」を加え、ロータリーエバポレーターに入れて、一定温度で均一になるまで撹拌し続けます。

カラムの口径5cmでシリカゲルの高さ10cmはちょっとアンバランスでしょう、もちろん吸着能が高い「乾いた」シリカゲルならそれでも良いかもしれません。この辺りは「実際に」やってみないと分からないところが多いので、初心者にはきついところがあります。私は院時代初めから終わりまでクロマトの連続でほとんど合成する暇がありませんでした。悲惨。

なお、注意点として特に長さが短いカラムでは「層が乱れないように」シリカゲルの上に数センチの海砂やカラム内径大の濾紙を乗せて、溶媒をつぎ込むときに固定相が乱れるのを防ぎます。

最後に重大なのが「マテリアルバランス」です。カラムにかけたものの内重量で何％が回収できたでしょうか。また、全ての試料を回収できるような「強い溶媒」があるでしょうか、「強い溶媒」があるなら試料は分解しない限り、何度でも分析し直すことが出来るからです。

もし、薄層クロマトの手法に慣れているようでしたら、初めに乗せる試料を少量取り分けておき、流れ出てくるサンプルと同じ条件で並べて展開してみると、一体どの辺りが現在流れ出ているのか、一応の目安が立てられます。脂質で紫外吸収が無ければセリウムやヨウ素、銀塩などで薄層を「焼いて」位置を検出します。

補足

ありがとうございます！返事が遅れて申し訳ありません。参考書によりますと、全脂質とケイ酸の重量比が１：75～100、ケイ酸カラムの径と高さの比が１：２０、流速が２～３ml/minとあります。最初、全脂質は２００mg、ケイ酸は２０ｇでやっていて、比はあっていたと思います。径は５ｃｍで高さは１０ｃｍ強で全然合っていません・・・。参考書の操作のところにカラムの高さは１２～１６ｃｍになる、と書いてあったので、１０ｃｍ強でいいのかなあと思いました。溶媒量はクロロホルム１７５ｍｌ、アセトン７００ｍｌ、メタノール１７５ｍｌで流していました。しかし、現在は一気に流す量をふやしたいと思い、試料１ｇ、クロロホルム７５０ml、アセトン３L、メタノール７５０ｍｌで流しています。もうめちゃくちゃかもしれません・・・。
しかも再利用できないなんてしりませんでした・・・。３つの溶媒を流し終えた後、普通にクロロホルムをもう一度流してまたそのまま使ってしまっています・・・。

回答No.1

noname#160321

(1)流れを止めると分かれた分画が拡散して分離が悪くなります。
(2)溶媒の変わり目で出て来るものも沢山ありますので採らないと皆んな捨てられてしまいます。特に急に溶媒が変わる部分には混合状態の方が良く解ける成分が濃縮されて出て来るので大変。

天然物については(有り難いことに)経験が少ないのですが、まず原料(試料)を沢山集めてくるしか方法がありません。あと、ある程度慣れるとシリカゲルの量を減らす事が出来るようになり、試料の量とシリカゲルの量の比によって溶媒量を調節できるようになるでしょう。
但し、カラムが細いとやはり時間も掛かります。
昔隣の研究室で植物成分(アルカロイド)の分離に太さ５センチ長さ２メートルのカラムを使っていましたが、やりたく無い。

お礼

ありがとうございます！さらにおききしたいことがあるのですが、暇があったら聞いてください。使っているカラムは5センチ、50cmなんですが、本の通りのシリカゲル量でやっていると、10センチくらいしかシリカゲルをいれていません。そうすると、流す溶媒の量とシリカゲル量、試料量などの比がうまく合わず、全て適当な量でやってしまっています。いいのでしょうか。また、一通り溶媒を流して、分画をとったあと、再度クロロホルムを流してシリカゲルを洗ってまた、分画をはじめているのですが、洗浄すれば何回でも分画を繰り返すことができるのでしょうか。本当は一回一回シリカゲルを捨てて新しいものを使うべきなのでしょうか。いろいろ聞いてしまってすいません。よろしくお願いいたします。