タンパク質実験

質問

これからタンパク質実験系を起こそうと考えているのですが、まず何をすればよいかわかりません。完全長cDNAはあります。まず、そのcDNAがコードするタンパク（protein kinase)の活性を調べたいのです。よろしくお願いします。へたな文章ですいません。

回答No.1

sfwaesr · ベストアンサー

おそらく、目的の遺伝子の酵素活性をとるためにどのようなロードマップで活性を証明できるのか？というご質問かと思います。

最もオーソドックスなやり方は、大腸菌の発現系で作製した目的タンパク質における酵素活性の証明、となると思います。

完全長のcDNAをお持ちであれば、その配列をpET(Novagen社)やpGEX(Amersham社)などの大腸菌発現ベクターに移し替えて、大腸菌に目的タンパク質を作らせます。その際に、大腸菌内に存在する様々なタンパク質の中から強制発現された目的のタンパク質のみを精製してくる必要があるので、HisタグやGSTタグの付いたタンパク質を発現させるのが一般的です。

タグによる精製（HisタグであればNiカラム、GSTタグであればGSHカラム）を行い、精製した後に基質と放射線ラベルされたP、そしてATPを加えて反応させ、基質に32Pが取り込まれるか電気泳動とラジオグラフィーで確認します。基質によっては32Pではなく、蛍光でみる方法もあります。

大腸菌の発現系でうまくタンパク質を出せないものがあれば、昆虫細胞発現系など別のシステムでタンパク質を発現させる必要があります。

長くなりましたが、流れとしては
「遺伝子を大腸菌／昆虫細胞発現系ベクターに移し替える」→「レコンビナントタンパク質を発現・精製する」→「in vitroのキナーゼ反応を行う→検出」

がよろしいかと思います。