site-directed mutagenesisについて

質問

site-directed mutagenesisをStratagene社のQuickChange Site-directed Mutagenesis Kitを使って行っているのですが、最終的にコロニーが全く生えてきません。形質転換の前のPCRはバンドがあり、増幅が確認しているのに、形質転換が上手くいってない気がします。考えられる理由・改善点を教えていただけないでしょうか？セルは添付のものを、培地はNZY培地がないのでSOC培地で代用しています。よろしくお願いします。

回答No.2

noname#17364

こんにちは。
　そうですね、はまりそうだったらやはりコントロールをおいて、失敗の原因が何処にあるのか分かるようにしながら進めるようにお勧めします。

　組換えに関しては、得られたプラスミドの長さと、いくつかの酵素で処理したときの泳動パターンが理論通りか、それともちろん変異を入れた部位の塩基配列を確認すれば良いと思います。大きなプラスミド6kbとか？であったり、LTRを含んでいるような場合は組換えが起こる可能性が少し高いようです。

補足

プロトコールどおりの培地を使って形質転換しましたが、コントロールでも菌は生えてきませんでした。
失敗の原因が全く分かりません。。なにかアドバイスお願いします。

回答No.1

noname#17364

こんにちは。同じの使ったことありますが、やはりマニュアル通りの培地を使うこと、抗生剤を再確認すること、でしょうか。あまり詳しくないですが、これのセルは変異を入れたプラスミドを増やせる特殊なstrainみたいなので、培地に影響される可能性もあるのでは？

生えてくればたいてい変異は入ってますが、プラスミド内で組換えが起こっちゃってる場合も結構あるので、注意して確認した方が良いですよ。

補足

ご回答ありがとうございます。マニュアルどおりの培地を使って検討してみたいと思います。まず培地の材料を購入しなければならないですが・・・。
プラスミド内での組換えのことですが、具体的にどのようなことになるのでしょうか？また、確認する方法はございますでしょうか？
よろしくお願いいたします。