ベストアンサー TAクローニング用ベクター 2004/09/28 10:50 TAクローニング用ベクターって自分で作ることはできないんでしょうか？回答よろしくお願いします。 みんなの回答 （2） 専門家の回答 質問者が選んだベストアンサー ベストアンサー ice_rif ベストアンサー率20% (68/325) 2004/09/28 15:36 回答No.2 できます。 割と有名な論文です。PubMedで全文読めます。 Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19(5):1154. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS. 質問者 お礼 2004/09/28 15:45 大変参考になりました。本当にありがとうございます。 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 その他の回答 (1) Dr_Hyper ベストアンサー率41% (2484/6033) 2004/09/28 12:07 回答No.1 BstNIで切ればT突出のサイトがつくれます。 質問者 お礼 2004/09/28 15:44 大変申し訳ないのですがBstNIで消化すると一方はT突出末端となるのですがもう一方はA突出末端になるのではないでしょうか？ 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 カテゴリ 学問・教育自然科学生物学 関連するQ&A TAクローニング後のシークエンスに関して教えてください。 TAクローニング後のシークエンスに関して教えてください。 生命工学の分野で実験している大学生です。 現在、遺伝子のクローニングを行っています。 ある生物由来のRNAからcDNAを合成し、cDNAをテンプレートとして約1000bpの目的遺伝子をPCRにて増幅、増幅断片をTAクローニングでTAベクターに入れました。 インサートの確認をするため、ベクタープライマーでシークエンスをしましたが、その配列の解読に困っています・・ フォワードのプライマーで読んだ配列は、目的遺伝子配列の相補鎖となっていました。これで、3'側が900bpほど確認できました。しかし、リバースのプライマーで読んだ配列がどうなっているのかよくわかりません・・。 TAクローニングではインサートが逆向きになることがあるとのことですが、これはそのケースでしょうか？その場合、リバースプライマーで読んだ配列はどのような配列になるのでしょうか？ 初投稿で読みにくい、説明不足な点もあるかと思いますが回答よろしくお願いします。 TA-クローニング法について TA-クローニング法について 通常のライゲーションと違い、TA-クローニングでライゲーションを行うメリットはどのようなものでしょか。 わかる方、回答よろしくお願いいたします。 TAクローニング ある細菌ゲノムの一部（石油成分分解酵素）をシーケンスしているのですが、読めません。 TAクローニングすると読めるようになるのでしょうか？ TAクローニングの利点について教えてほしいです。 天文学のお話。日本ではどのように考えられていた？ OKWAVE コラム TAクローニングが上手くいきません。何故？ ＴＡクローニングの際、エレクトロポレーションによる1度目の失敗以降コンピを作り直し、気泡に注意しながら再度エレクトロポレーションを施してSOC培地中で培養し、LB＋amp培地上に塗布しました。37℃の下で16時間培養しました。 しかし翌日。 全くコロニーが確認出来ませんでした。 何故なんでしょうか？ ＴＡクローニングを始めて日が浅く、知識もまだまだ不十分なので、助言をいただければ幸いです。よろしくお願いします。 TAクローニング 今度はじめてTAクローニングをしようと思っているのですが、 よく使われているインビトロジェンのキットは、高すぎて使えません。。 形質転換はエレクトロポレーションでしようと思いますので、コンピテントセルは セットに入っていなくて、安価でおすすめなキットがあれば教えていただけないでしょうか？ キットでなくても、これとこれを使えば出来る、という方法があれば合わせて 教えていただきたく思います。よろしくお願いします。 クローニングベクター 約1700bpのPCR産物をクローニングしたいのですが、サイズ的にZero Blunt TOPO PCRクローニングキットの3.5kbpのベクターでも可能でしょうか？ インサートDNAが長いTAクローニング 農学部に所属している大学4年生です。 現在実験でTAクローニングを行っているのですが、うまくいっていなくて困っています。 原因は、おそらく使用しているT-vectorに対してインサートDNAがかなり長く、ライゲーションしにくいためであると思われます。 使用しているT-vectorは、TAKARAのT-vector pMD19(Simple)で約2.7kb、インサートDNAは約6.3kbです。 ベクターとインサートの比はかなりのパターンを試していますが、T-vectorの残量が少ないために、いつも0.5～3µl程度しか使っていません。 ライゲーション時間や温度は、はじめは4℃でオーバーナイトなどで行っていましたが、ライゲーションキット（TAKARA DNA Ligation Kit ver 2.1）の説明書に「TAクローニングの場合は1時間以内で行うこと」とあったため、現在は16℃30分で行っています。 そこで質問させていただきたいのは (1)普通、ベクター：インサート＝１：３～５の濃度で行うと聞いたのですが、ベクターよりもインサートの方が長い場合はベクターの濃度を濃くした方が良いのでしょうか？ (2)ライゲーション時間や温度はもっといい条件があるでしょうか？ ご意見をいただければありがたいです。よろしくおねがいします。 クローニング 現在遺伝子クローニングをしていて、遺伝子の部分配列（５００ｂｐ）のクローニングに成功しました。今全長をとろうとしているのですが、自分でふと思いついた方法にみなさん意見ください。その方法とは (1)ゲノムを適当な制限酵素で切りサザンを行う。 (2)その結果からサザンででたバンドを切り出す。 (3)プラスミドにライゲーションする。 ここからオリジナルですが (4)形質転換せずに（コロハイせずに）カラムで精製して部分配列のプライマー （それぞれの方向に伸びるプライマーを２種用意）とベクター上のプライマーで ＰＣＲをかける。 (5)得られたバンドをＴＡクローニングする。 (6)全長が得られるまで(1)から(5)を繰り返し行なう クローニング 現在クローニングである遺伝子の上流をつっております。 今-3kbpまでつったベクター(PGL4.17ベクター(発現ベクター)にサブクローニング済)があります。 しかし、もっと長くしなければいけないことがわかったので、 さらに-3kbpから-5kbpの領域をクローニングして-3kbpが入ったものとつなげたいと思っています。 そのつなげかたを教えていただきたいです。 領域をかぶらせて同じ酵素サイトをもつようにしたりするのでしょうか。よくわかりません…。 ちなみにサブクローニングの制限酵素はsacI,xhoIを用いました。 初心者なので詳しく説明していただけるとうれしいです。 よろしくお願いします。 シーケンスが上手くいきません。TAクローニングを行う利点とは!? はじめまして。現在自分は理系の大学に通う4年生です。 生物学に重きを置く研究室で、未知遺伝子の解析を行っています。 先月その未知領域を思われるＤＮＡの増幅に成功しました。早速シーケンスを施したところ、ＧやＮだらけでピークも低く、上手く読めていませんでした。ここで自分なりに考察した事は以下の通りです。 1.不純物除去のためエタノールによる沈殿を施した際、エタノールと一緒にＤＮＡも捨ててしまった(要するに実験が下手クソ)。 2.上と同じ操作の際、エタノールの乾燥除去の際、幾つかのＤＮＡが熱変性した。 3.ＰＣＲの際、アニーリング温度が不適当。 素人考えで恐縮ですが、こんな事です。 以上の話を教授と相談したところ、『ダイレクトシーケンスを行うよりは、ＴＡクローニングをした後にシーケンス解析をしてみよう』と言うことになりました。 幾つか説明を聞いたところ、勉強不足な自分は半分くらいしか理解していません。ベクターに対応するプライマーを用いることでＰＣＲ産物全域を読める事くらいしか…。 もし詳しく解る方、同じような経験をお持ちの方がいらっしゃれば、ご意見をお聞かせ下さい。 巨大プラスミドのクローニング 目的遺伝子の含まれるDNAが巨大プラスミドなどの大きなDNAである場合に目的断片がクローニングされる確率が低くなるのはどうしてですか。また、そのような場合に目的断片がベクターに組み込まれる確率を上げるためにはどのような工夫をすればいいのですか。 クローニングとサブクローニング（長文になってしまいました） 植物を実験材料として扱っているのですが、植物からある特定の遺伝子を単離して、発現ベクターへ組み込む際、RT-PCR等でまずその特定の遺伝子を単離したとします。 この単離した遺伝子をまずpUC119等のベクターに組み込んでシークエンス解析を行い、配列が正しいか確認します。 シークエンス解析をし、あたりの配列をまた切り出して、発現ベクターへ組み込みます。 この作業において、僕は今までそれぞれここの作業はクローニング、実験系全体を見ると、pUC119に導入するのはサブクローニングで、発現ベクターに導入するのがクローニングだと思っていたのですが、どうも違うようなのです。 どなたかこの2つの言葉の違いをはっきりとした定義を教えていただけないでしょうか？（まわりくどい説明で申し訳ありません） 日本史の転換点？：赤穂浪士、池田屋事件、禁門の変に見る武士の忠義と正義 OKWAVE コラム DNAクローニングのメカニズムを教えてください！ バクテリアを大腸菌にクローニングするメカニズムを教えてください。遺伝子の組み込みはどんな方法原理で行っているのか、また、組み込みのベクターの選定は何に影響するのかなど、まったくの素人です。一言では、いえないとは思いますが・・・。 ベクターの選択 遺伝子研究でベクターがよく使われていますが、どんな場合にどのベクターを用いるのかという選択の基準はどのようになっているのでしょうか？ 具体的には １クローニングベクターと発現ベクターはベクターの何が違うのですか？ ２プラスミドベクターやファージベクターをどう使い分けるのですか？ ３同じプラスミドベクターでもpucやpblueやPBRだどがありますがどう使い分け ているのでしょうか？ 詳しい方教えてください クローニングベクターの詳しい情報を探すには？ ベクターの名前から、配列やマップなど詳しい情報を探そうとしています。これらの情報を手に入れるには、どこで探せばよいのでしょうか？Genbankなどでさがせるのでしょうか？ 販売されているものならば、そこのホームページで探せるとは思いますが、誰かが作ったベクターとなると、見つけるのが大変です。 今は、NpT7-5ベクターの詳しい情報を探しています。 ヒト・クローニングについて 大学の課題でヒト・クローニングのレポートを書くのですが、ヒト・クローニングは社会における利点が多く、ヒト・クローニングに反対する意見を考えることのほうが難しいですよね？？ ヒト・クローニングにおける大きな問題点とは何でしょうか？ ヒト・クローニングを反対する立場から相手を納得させるような説得力ある文章を書くためにはどのような問題に目を向けるべきでしょうか？？ わかりづらい文章ですみません 制限酵素マップ、マルチクローニングサイトについて。 マルチクローニングサイト、制限酵素マップについて。 先ほど制限酵素マップについていろいろと調べてましたが、よくわかりませんので、すみませんが質問させていただきます。 pGEXベクターについての下記の URLの図なのですが、この図がベクターを表しており、oriが、複製起点なのはわかりましたが、あとのおおまかな図の意味と、上に書いてある、pGEX-6P-3などが何を意味してるのかわかりません。いろいろネット上をみてましたがそういう解説があるサイトもみつけられませんでした。あとこの図でマルチクローニングサイトも何処なのかがわかりません。いろいろお手数ですがよろしくお願いいたします。http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/pdf/04_00003.pdf#search='マルチクローニング pGEX' cDNAライブラリー作製のベクター選択 初めてcDNAライブラリーを作製しようと思っています。 ある生物体の代謝経路に関与する遺伝子のクローニングを試みており、cDNAライブラリーを作製することにしました。カタログをみるとベクターはファージとかプラスミドとか、その他もありますよね。 インサートサイズが違うということはわかりました。 自分が目的とする代謝経路はまだ不明な点が多く、クローニングもほとんどされていません。ただ唯一クローニングできた遺伝子の長さはcDNAで3kbでした。この場合、プラスミドベクターとファージベクターどちらを選べばいいのでしょうか。 インサートサイズだけ見るとプラスミドの場合、100bp~10kb、ファージベクターが10kbくらいとありましたが、そうするとプラスミドベクターになるのでしょうが、本を見るとファージベクターがほどんどでした。どちらを選んでいいのかわからないのです。 また、プラスミドベクターとファージベクターの長所短所がよくわかっていないのも、選択に迷っている原因だと思います。 生物種や目的遺伝子の表記があいまいでごめんなさい。アドバイス求めています。よろしくおねがいします。 Surfaceのクローニングについて SurfacePro3を１００台程度導入予定ですが、 イメージの配信（クローニングソフト（SymantecGhostなど）で クローニング可能なのでしょうか？ 有線のLANありませんの心配しております。 検証された方等いらっしゃいましたらご教示いただけませんでしょうか？ よろしくお願いいたします。 遺伝子診断-ポジショナルクローニング 今、『嚢胞性線維症における遺伝子診断では何を調べるのか？』ということを調べています。自分で調べたところ、『ポジショナルクローニング』という方法を使うらしいということは分かったのですが、これは正しいのでしょうか？ ここで『ポジショナルクローニング』とはどういう方法なのかを一般人にも分かりやすく教えていただきたいのです。また、もし詳しい方がいらっしゃれば『嚢胞性線維症』ではポジショナルクローニング法によって何を調べるのかも教えてください。分かる範囲でよろしいのでよろしくお願いします。 注目のQ&A 「You」や「I」が入った曲といえば？ Part2 結婚について考えていない大学生の彼氏について 関東の方に聞きたいです 大阪万博について 駅の清涼飲料水自販機 不倫の慰謝料の請求について 新型コロナウイルスがもたらした功績について教えて 旧姓を使う理由。 回復メディアの保存方法 好きな人を諦める方法 小諸市（長野県）在住でスキーやスノボをする方の用具 カテゴリ 学問・教育 自然科学 理科（小学校・中学校）化学物理学科学生物学地学天文学・宇宙科学環境学・生態学その他（自然科学） カテゴリ一覧を見る OKWAVE コラム 突然のトラブル？プリンター・メール・LINE編 携帯料金を賢く見直す！格安SIMと端末選びのポイントは？ 友達って必要？友情って何だろう 大震災時の現実とは？私たちができる備え 「結婚相談所は恥ずかしい」は時代遅れ！負け組の誤解と出会いの掴み方 あなたにピッタリな商品が見つかる！ OKWAVE セレクト コスメ化粧品 化粧水・クレンジングなど 健康食品・サプリ コンブチャなど バス用品 入浴剤・アミノ酸シャンプーなど スマホアプリ マッチングアプリなど ヘアケア 白髪染めヘアカラーなど インターネット回線 プロバイダ、光回線など
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