ビオチン標識について

質問

プローブを作る際にPCRにかけて増幅させた後、泳動させて増幅確認をしているのですが、ビオチンを付けていない物とバンドに差が出ません。これってビオチンがうまく標識されてないって事ですよね？試薬なども変えてみたのですが、やっぱりうまくいきません。あとはビオチンしか思いつかないのですが、使用期限みたいなものはあるのでしょうか？　また、他に考えられる原因、アドバイスなどがあったら教えて頂きたいです。
　わかりにくい質問で申し訳ありません。

回答No.1

takumicchi · ベストアンサー

正確な答えを出すのに情報が少なすぎますが、答えられる範囲でお答えします。

ビオチン標識プライマーを用いてPCRを行った場合、その断片とそうでないものはアガロースゲルで差は見えません。電気泳動によりその差をみたいなら、ロングサイズ(40cm)ぐらいのアクリルアミドで電気泳動しないとダメです。

プライマー標識の場合はPCRのバンドが増えていれば、
まず問題なく標識されています。それを、はっきり確認したいならストレプトアビジンとプローブを混ぜて未変性状態でアガロースゲルに流してください。ビオチン標識が入っていればPCRのバンドが大きくシフトします。

条件は0.8%アガロース（0.5x TBE）で50Vでゆっくり流します。ローディングバッファーとしてグリセロールが終濃度で10%になるように加えます。ダイは加え影響がでるかもしれないので、加えないほうが良いかもしれません。

二本鎖状態で流せばエチブロで検出可能です。ストレプトアビジンのプラスとマイナスで流せば差がはっきりみえるはずです。

お礼

お礼が遅くなってすみません。早速、やってみようと思います。ありがとうございます。

補足

補足して申し訳ないのですが、ニックトランスレーションを使ってビオチンをラベリングする際、どの会社の製品が良いですか？