バンドが消えた...

質問

今までばっちりバンドが出ていたPCRで、突然バンドが出なくなってしまいました。
試薬、サンプル、サイクラーを変えても出ません。
泳動後、エチブロで染色してUV下で見ると、ゲルの穴からスメアーのようになっています。
PCRはnestedまで行っています。
原因がわからず大変困っています。
どうかアドバイスをお願いします。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

＞ゲルの穴からスメアーのようになっています。

サイクル数が過剰で、PCR産物の重合が起こったときの症状のように思われます。サイクル数（特にnested PCRの）を減らしてみたらどうでしょう。
これまでその条件でOKだったのに、急におかしくなったというところはなぞですが、なにかの加減で今までより増えがよくなったため、これまでの反応条件ではやりすぎになってしまったのかも。

お礼

サイクル数を減らしてもダメでしたが、PCR産物が多すぎるのか...と思いtempの量を減らしたところ、バンドが復活しました！

ヒントを下さり、ありがとうございました。

回答No.2

rio2

ポジコンもかからないのであれば、試薬に問題があることも多々ありました。
いくつかのメジャーなTaq polymeraseでもロット差でかかったりかからなかったりがあったり、古くなって動かなくなることもしばしばあります。
経験的な話と幾人かからの話ですが、酵素は比較的ホットスタート酵素の方が安定な印象があります。

お礼

ありがとうございます。
試薬も新しいものに変えたりしてみたのですが、だめでした。
ホットスタートもしています。

回答No.1

MIYD

ゲルが古い可能性はあります。

昔にPCRして残っているサンプルがあれば、
それをポジコンとして流すことで、
電気泳動時に原因があるのかがわかります。

お礼

ありがとうございます。
ゲルは作りたてで、ラダーがきちんと流れていたので、泳動には問題がないように思います。