ジェノタイピングでのプライマー

質問

野生型マウスとノックアウトマウスでジェノタイピングを行っています。基本的なことなんですが、使用するプライマーが３本だったり４本だったり、通常のRE-PCRのように２本ではない理由はなんでしょうか？ご教授お願いいたします。

回答No.2

browntraut · ベストアンサー

No1です。

3本の場合は、Fw:1、Rv:3だったり、Fw:3、Rv:1の場合が。

4本の場合は、欠失部分もしくは挿入部分を増やすのに1ペア、それ以外の部分（ワイルド部）に1ペアという解釈です。

お礼

遅くなってすみません。わかりやすい解説ありがとうございます！納得できました。

回答No.1

browntraut

ノックアウトをどうやって作ったかを考えれば答えが見つかります。
目的のゲノム遺伝子にある程度の長さの欠失、もしくは余計な遺伝子を挿入させ、遺伝子を発現できないようにさせています。

仰るように通常のPCRはプライマーはペア（2種類）ですが、KOのジェノタイピングなどの場合は、プライマーペアをこの欠失部分や余計な配列上にも設計します。

このような場所にプライマーを設計すると、欠失や余計な配列があると増幅したり、逆にしなかったりする訳です。
ワイルドタイプとはPCRパターンが違くなりますね？
もちろん、ワイルドタイプのバンドもちゃんとでるようなプライマーペアも必要です（PCRはOKプライマーと別々でもOKだし、PCRがかかることがわかっていれば、ミックスプライマーで一緒にPCRをかけられます）。

染色体は2本ですので、ワイルドバンドとOKバンドのパターンを見て、
WTxWT、WTxKO（ヘテロ）、KOxKO（ホモ）の3種類のゲノムがわかるようになります。

補足

ありがとうございます。
3本の場合はフォワードプライマーが共通でリバースがそれぞれ違うということですよね？4本の場合はフォワードもそれぞれ違うということでいいんでしょうか？

それならフォワードが１つでいい３本で設計したほうが楽だと思うのですが、何か４本にしなければいけない理由はあるのでしょうか？