ウェスタンブロットで、ノンスペとブロードなバンドに悩み中

質問

ウェスタンブロットで、ノンスペとブロードなバンドに悩み中

動物の組織をサンプルとしたWBを行っているのですが、
目的のバンドにブロード（スメア）なノンスペのバンドが被ってしまって困っています。
このノンスペバンドを無くして目的のバンドのみを検出するいい方法はないでしょうか？

回答No.2

taka_yu

ECL Plusは高感度な分、反応させすぎたりしてノンスペが出やすい印象があります。しかし、条件検討されているようなので変わらないかもしれないですね。ノンスペはよくある話なのでブロッキングを変えてみるとかいろいろあるみたいです（過去レスにもありました）。言いたいことが言えるのであればあまり気にしないというのもありかと。。

お礼

ブロッキングも、skim milkとBSAで検討したんですが、全く変わらずでした・・・。
流すタンパク量を1/3にしたら、ブロードなバンドはなくなったのですが、相変わらず出てくるノンスペ・・・。
ちょうど目的タンパクに被るので、邪魔でしょうがないです。

回答No.1

taka_yu

まず抗体を変えてみるのがよいと思います。あとはサンプルを超遠心や限外ろ過で分画してみる、ECL pulseを普通のやつに変えてみる、でしょうか。

お礼

回答ありがとうございます。
抗体はこの問題のやつに関しては２社のでやってるんですが、どっちも出てくるんです。
他に、４～６種類くらい別のタンパクの抗体でも出てくるので、厄介極まりないんです。
こっちは目的タンパクの位置と被らないので問題ないんですが。

超遠心と限外ろ過はしたことないので・・・。
ECL　plusを普通のというのは、一つ下のグレードのやつってことですか？
一応、ECL plusを混ぜた後に蒸留水で×２、×３希釈とかしてもダメだったので、諦めてたのですが。