今、ホールマウントin situハイブリダイゼーション でウニの遺伝子

質問

今、ホールマウントin situハイブリダイゼーション　でウニの遺伝子の染色やってるのですが
RNAプローブを胚に加えて一週間ほどインキュベートした後、MOPS　バッファーで何度も洗うのはなぜですか？

それから加えるRNAプローブの濃度が0.1ng/mlだったのですが、もし加えるRNAプローブの濃度を高くしたら（100ng/ul)何が起こるのでしょうか？

回答No.1

otx · ベストアンサー

>MOPSバッファーで何度も洗うのはなぜですか？

原理的にはRNAプローブは相補的なmRNAに結合するのですが、
そもそも発現しているmRNAに比べて0.1ng/mlという濃度は「超」多すぎる、過剰量のRNAです。
なので、目的のRNA以外の何かしらに引っ付いていたり、引っかかっていたります。
それらを洗い流す必要があるからです。

目が小さいスポンジをRNA溶液中に浸して洗わずに次の工程に進むか、
しばらく何かの液に浸して洗ってから次の工程に進むか、
これを想像すると、何となくわかると思います。

＞もし加えるRNAプローブの濃度を高くしたら（100ng/ul)何が起こるのでしょうか？

先にも述べましたが、0.1ng/mlという濃度は「超」多すぎる、過剰量のRNAです。
なので、それ以上というと、さらに目的のRNA以外に引っ付いたり、引っかかったりする確立が高まります。

あと、必要以上のものを使うと、経済的にも厳しいです。

お礼

早速回答していただきありがとうございました。
大変解りやすく助かりました。
もうひとつお伺いしたいのですが、そもそもMOPSバッファーで洗い流すとき、MOPSバッファーはどのように作用するのでしょうか？
MOPSバッファーでなければいけない理由はあるのでしょうか？