プローブの合成

質問

in situ ハイブリダイゼーションを行おうと考えています。
RNAプローブを合成するときには、T7、T3などのRNAポリメラーゼが結合するプロモーターが合成用テンプレートに必要であると本に書いてありました。どのようにしてプロモーターを連結させるのでしょうか？
また、DNAプローブを合成する時にはPCRしたテンプレートをそのまま使ってラベリングしても大丈夫なのでしょうか？

回答No.1

takumicchi · ベストアンサー

T7プロモーターをつけるのはin vitro 転写をしてRNAプローブを合成するためだと思います。従ってプローブのテンプレートとなるDNAの5'側に連結させます。連結方法は5'側にT7プロモーターを導入したセンスプライマーと普通のアンチセンスプライマーを用いてPCRすると、T7プロモーターのついたDNAテンプレートができます。この手法は自分の入れたい配列を入れるのに多用される手法です。このPCRプロダクトをエタ沈後、T7 RNA polで転写すれば簡単に大量のRNAが得られます。ちなみにT7プロモーターの直後はGを入れておかないと極端に転写量が落ちるので注意しましょう。

DNAプローブの場合、通常のPCRしたらダブルストランドになっていますよ。DNAの場合はRNAよりも化学合成が簡単なので、シングルストランドDNAを外注で合成してもらった方が楽にできます。そのssDNAをラベルすればいいと思います。