細胞培養での細菌のコンタミ

質問

細胞培養の初心者ですが，細菌のコンタミに関して質問です．
0.2マイクロのシリンジディスク型フィルター（ミリポアのMillex-LG,#SLLGH25NS)でろ過した培地のみをインキュベートしたにもかかわらず，細菌らしきものが観察されました．ひょっとするとマイコプラズマでしょうか？しかし，マイコプラズマは顕微鏡下では観察できないですよね？
ちなみに培地には抗生物質（ペニシリン+ストレプトマイシン）を標準濃度で加えております．比較のために5倍濃度も調整しましたが，全然効果がないようです．
原因を探るべく，いろいろと条件比較をしておりますが，どうやら血清が怪しいことがわかりました．血清の添加は液体培地をフィルター滅菌してから加えておりました．通常，血清は滅菌する必要はないと聞いたのですが，分注するときにコンタミしたのでしょうかね？あまり考えられないのですが．
そこで質問です．
Q１．シリンジディスク型フィルターのろ過滅菌の有効性についてコメントしてください．
Q２．細菌に有効な抗生物質（比較的安価なもの）で，いいものがあれば教えてください．いまのところ，アンピシリンとカナマイシンを考えております．
Q３．血清の滅菌について，どのように対処されていますか？ろ過滅菌では目詰まりが酷いと思われますが．．．

アドバイスをよろしくお願いします．

回答No.3

wriwri · ベストアンサー

Q1:　ディスクの下側（液が出てくる側）さえ滅菌的であれば大丈夫です。また、滅菌した溶液を受けるチューブは滅菌されてますか？

Q2:ゲンタマイシンをお勧めします。P/Sでは耐性菌が生まれやすいですが、ゲンタではまずそのようなことは起こらないといわれています。

Q3:血清を加えた培養液（１０％あるいは５％）をフィルター滅菌することをお勧めします。ただし陰圧にしすぎると泡が発生して返ってコンタミの原因になりますのでうまく調節してください。

まず、本当に細菌なのか、細胞のDebrisなのか確認されたら如何でしょうか。細胞種（特に接着系細胞）によってはDebrisが多く観察される場合があります。

お礼

ご回答ありがとうございます．
新しく使用するコニカルチューブはすべて滅菌済み未開封（キャップ）のものを使用していますが，培地やPBSなどは50mlチューブに適宜継ぎ足していました．ただし，今回のディスク滅菌では直接，滅菌済みの新品ディッシュに分注したにもかかわらずコンタミしていましたので，原因がわからず悩んでいました．クリーンベンチの使い方も含めてみなさまのアドバイスを参考にして再度，原因究明したいと思います．
ゲンタマイシンも是非使用してみます．血清培地もフィルター滅菌してみます．培地のみのディッシュから細菌が増殖したので，Debrisではないことは，明らかだと思います．

回答No.2

otx

抗生物質を入れていようとも、私はそれが万能とは考えていません。
環境が悪ければ何かしらがコンタミしてしまうときはします。

１、有効だと思います。しかし、へたくそが操作すると、濾過滅菌して出てきた液に操作しながらコンタミさせるということもありますので、何とも言えません。

２、通常はペニシリン+ストレプトマイシンでなんら問題ありません。
抗生物質を疑うことも重要ですが、ラボの他のメンバーとコンタミしているのでしょうか？
こういうことはラボのメンバーで情報を共有して、何が問題なのか話し合うのが普通かと思います。インキュベーターの汚染や、部屋のエアコンの汚染など、環境要因などもコンタミの原因です。

また、質問者様がどのようなものを見て、細菌と判断されているのか分かりませんが、カビや酵母には使っている抗生物質は効きません。

ネットでも、実験所でもコンタミを検索したら沢山対処法があります。
一例を
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=171

３、私はしたことありません。しなくても問題ないと思いますが、売ってあるものがコンタミしていることは無くはないと思います。
他のラボメンバーと話してみて、血清が問題とわかれば、破棄することが最も効果的だと思います。

他のラボメンバー等と話し合うことをお勧めします。
そうしないと、他の人にも迷惑が及ぶことがありますので。

お礼

ご回答ありがとうございます．
ろ過滅菌の手技についても細心の注意を払っていきたいと思います．カビや酵母ではなく，明らかに細菌の類です．ブラウン運動が見られます．今のところクリーンベンチおよびインキュベーターは私しか使用していません．初心者が立ち上げしていますので，何かと苦労するのですが，専門の先生や他のラボの諸氏にも相談しております．
教えていただいたURLの情報も大変参考になりました．

回答No.1

owata-www

仮にマイコプラズマだった場合、ろ過滅菌（おそらく0.22μmだと思いますが）でも通過してしまいます　ただし、普通は顕微鏡で観察できませんが

Ｑ１通常の細菌ならろ過滅菌でも充分かと思いますが　マイコプラズマを心配しているならＰＣＲで検出できるので（特定の種だけですが）、調べてみてください

Ｑ２特に他には思いつきません

Ｑ３してません、特にしなくても普通にできます　

血清が不安なら、変えた方が無難だと思います　確かに高いですが

あと、クリーンベンチ内、実験器具の汚染はないかどうかも調べたほうがいいかと

お礼

早速のご回答ありがとうございます．
ご意見を参考にさせていただきます．