大腸菌の形質転換

質問

とりあえずプラスミドを増やそうとプラスミドだけをコンピテントセルに導入しようとしているのですが、なぜだか寒天培地に生えないんです。
抗生物質入りのにも抗生物質なしのものにも生えなくて困ってます。
同濃度の抗生物質入りの液体培地では増殖が確認されるのですが、寒天培地には生えないというのはやっぱり変ですよね？
播くときの濃度が薄すぎるのかと思い、遠心分離して濃度を上げたんですが、それでも駄目でした。
ちなみに多量にLB培地を作成し、そこからフラスコに100ｍLほど採ってアガロースを加えて滅菌しています。
つまり液体培地と寒天培地はアガロースの有無しか違いがありません。
形質転換については経験のある方にもお願いして実験してもらいましたが失敗されてました・・・ということで形質転換を行うときの操作に問題があるとは考えにくいかと思っています。
解決策が見出せず本当に困ってます。
心当たりのある方、よろしくお願いします。

回答No.8

sewingcough · ベストアンサー

> お礼が遅くなって申し訳ありません。
> 培地を作るのにミリQを使ってたような気がします・・・
> ミリQの方がコンタミとかもなくていいかなと思っていたのですが、
> なぜ増殖が遅くなるのですか？
LBだけではメタルがどうしても不足するため、
MilliQで培地を作ると増殖がかなり遅くなります。
これが最小培地ならばびっくりするほど遅くなります。
ですので培地をつくるときはDIWやROを使う人が多いようです。
とはいえ「MilliQ派」の人もそこそこいます。
たとえばメタルと結合する様なたんぱく質を扱う場合など
綺麗な水の方が安心だから・・・とか、そういうことでしょう。

ちなみに、いずれにせよオートクレーブするので
水道水で培地を調製しても全く問題はありません。
それどころか、むしろ増えるのが非常に速くなるので
「水道水派」のひともかなりいます。

私は学生のころは水道水を使ってましたが、
メタルバインディングのたんぱく質を扱った頃から
DIWを使うようになりました。だって水道水だと
カドミウムとか入ってたら困るじゃないですか？
（たんぱく質と関係なく困る気もしますが・・・）

お礼

なるほど～
確かにオートクレーブするなら水道水でも問題なさそうですね。
でも研究所によって水道水の組成が微妙に違ってくるような(笑)
一度DIWで作り直してみます。
ありがとうございました。

回答No.7

sewingcough

#4です。「プレートがイケテナイ」に関して思い出したことを追加。
表面が結露したプレートを使うとあまりよくないという話もあります。
ですので、冷蔵保存したプレートを使う場合は、
37℃で20-30分くらい乾かしてから使った方がいいです。

お礼

お礼が遅くなって申し訳ありません。
培地を作るのにミリQを使ってたような気がします・・・
ミリQの方がコンタミとかもなくていいかなと思っていたのですが、
なぜ増殖が遅くなるのですか？

回答No.6

sewingcough

#4です。
> プレートが悪いというのは具体的にはどのような感じでしょう？
> 組成は間違ってませんし、量が少ないということですか？
組成を間違っていないとしたら、例えばMilli-Qで作っているとか。
まあ大抵の場合はMilli-Qで作っても遅いだけでちゃんと増えますが。
あとは、とうぜんちゃんと冷えていないプレートにまいてもダメですが、
といってもそんなことはおそらくしないでしょうからねえ・・・。

最初に疑ったのが、DH5αのコンピテンシーが低いかどうかですが、
otoykmorfさんのプロトコルを見ると大量にプラスミドを入れているようなので
（私の場合はコンピテントセル20uLにつきプラスミド1ngしか入れません）
おそらくコンピテンシーは問題にならないんじゃないかと思います。
次に疑わしいのは、バイアビリティが低いんじゃないかということです。
使ってるDH5α、実はほとんど死んでるんじゃないかな？と。
例えば購入したものを保存するまでの間に誰かが室温に放置したとか、
一度融かしたものを誰かが再度ディープフリーザに入れたとか。
液体培養で対数増殖期に入るまでの時間が異常に長い場合は多分それです。

あと、SOCがイケテナイ可能性はないですか？既製品なら問題ないでしょうけど。
もし既製品ではなく自作だとしたら、一度LBで回復培養してもいいかもしれません。
それでうまくいくとしたら、SOCの組成が間違ってた可能性が高いです。

他には、湯浴につかった恒温槽の温度は正確ですか？
例えばうちのラボでは37度に設定したのに50度近くまで温度が上がる
という事件が一度ありました。気付かなかったら大変なことになってました。

回答No.5

sewingcough

とりあえず液体培地で増えるなら、液体培地で回復培養して
それをプレートにまいたら生えるんじゃないかと思いますが、
「抗生物質なしのものにも生えない」というのは異常事態ですね。
おそらくコンピテントセルがおかしいのではないかな？って気がします。
プラスミドに組み込んだタンパク質の毒性が高い可能性は
プラスミドを増やすための大腸菌では少ないと思いますし。
以下の実験で問題を切り分けてみればいいのではないでしょうか？

(1) 別のプラスミド・同じ大腸菌を使ったプレート培養
(2) 同じプラスミド・別の大腸菌を使ったプレート培養
(3) 別のプラスミド・別の大腸菌を使ったプレート培養（ポジコン）

「別の大腸菌」はBLとかJMとかの(DE3)いいです。
(1)が×で(2)が○なら大腸菌が悪い、
(1)が○で(2)が×ならプラスミドが悪い。
(1)も(2)も×ならプレートが悪い、
(1)も(2)も○なら腕が悪いと言うことだと思います。

お礼

液体培地で回復培養したものを播くとコロニーができました。
とりあえずコロニーを拾って増やしてプラスミドが目的のものかチェックしてみます。
今後の実験のことを考えると原因をつきとめないといけませんね・・・
プレートが悪いというのは具体的にはどのような感じでしょう？
組成は間違ってませんし、量が少ないということですか？

回答No.4

sewingcough

とりあえず液体培地で増えるなら、液体培地で回復培養して
それをプレートにまいたら生えるんじゃないかと思いますが、
「抗生物質なしのものにも生えない」というのは異常事態ですね。
おそらくコンピテントセルがおかしいのではないかな？って気がします。
プラスミドに組み込んだタンパク質の毒性が高い可能性は
プラスミドを増やすための大腸菌では少ないと思いますし。
以下の実験で問題を切り分けてみればいいのではないでしょうか？

(1) 別のプラスミド・同じ大腸菌を使ったプレート培養
(2) 同じプラスミド・別の大腸菌を使ったプレート培養
(3) 別のプラスミド・別の大腸菌を使ったプレート培養（ポジコン）

「別の大腸菌」はBLとかJMとかの(DE3)いいです。
(1)が×で(2)が○なら大腸菌が悪い、
(1)が○で(2)が×ならプラスミドが悪い。
(1)も(2)も×ならプレートが悪い、
(1)も(2)も○なら腕が悪いと言うことだと思います。

回答No.3

sirouto1gou

トランスフォーメーション前のコンピテントセルはLB brothで増えますか？

下記は可能性としては低いのですが
プラスミドは購入されたものを直接使用されているのですか？
製品として購入しても意外とプラスミドは壊れているものもあります。
addgene等から手配しているものは民間には販売せず、非営利団体には原則大幅に安価なのでノークレームでお願いされる事もあるでしょう(そのため日本の商社は手が出せない代表的な団体です)
シークエンスする必要もあるかもしれません(コストは高いですが)。
他のプラスミドで代替できるのであればそちらも試行してみるとか...

何れにしましてもまずコンピテントセルがちゃんとしているかどうかから始められる事をお奨めします。

回答No.2

fish-1091

No.1ですが・・・。

ちょっと気になりまして。

抗生物質の入っていない培地でもコロニーできないんですよね？？

どんなコンピ使ってるんですか？？

お礼

早速のご回答ありがとうございます。
コンピはtakaraさんのDH5αです。抗生物質の入っていない寒天培地でもコロニーができません・・・
プロトコルは以下の通りです。
100μlのコンピを氷上で解凍後、pGEX6P-1ベクター500μg/mlを1μl加え30分間氷上でインキュベートしてます。
その後42℃の湯浴で45秒間ヒートショックを与え、コンピに付属のSOCを900μl加え、1分間氷上に置いた後、37℃で1時間振とう培養してます。
ちなみに振とう培養の時間を30分、45分に変えてみたこともありますが結果は同じでした。
振とう培養後、100μlをアンピシリン含有培地に播いてます。
・・・普通のプロトコルだと思います。
とりあえず液体培地で増殖した大腸菌を抗生物質含有寒天培地に播こうと思ってますが、今後目的の遺伝子を導入したときに失敗すると怖いので困ってます・・・
よろしくお願いします。

回答No.1

fish-1091

他のプラスミドを同じプロトコールでトラフォメしたことありますか？？

たとえば・・・

同じコンピでほかの人はトラフォメしてコロニーが得られても自分だけできないとか・・・

今行っている手順を示してもらったほうが判断しやすいです。