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SDS-PAGEのゲルが固まらない
卒論で尿のSDSーPAGEを行っている大学生です。 一年半くらいずっと実験をしているのですが、ここ1ヶ月くらい急に全くゲルが固まらなくなり、実験が滞っています。今までずっと行ってきた実験なので今更手技的に間違っていないのでどうしていいかわかりません。 ＜使用試薬＞ ・30%Acrylamide mix ・0.75M Tris-Hcl(pH8.8) ・0.25M Tris-Hcl(pH6.8) ・TEMED ・10%SDS ・25%APS 試薬は今までどおりのを使ってましたが、ある日急に固まらなくなり、何度チャレンジしても固まらないので、試薬も作り変えて、APSも新しいのを買って作り、配合を間違えないようにきっちりworksheetをみながらやっているのですが、いままで20分もあれば固まっていた分離ゲル(アクリルアミド12％）も1時間しても液体のままで、濃縮ゲルにいたっては固まらずレーンができないんです。どうすればいいか分からなくて本当に困っています。アドバイスや経験談を教えていただきたいです。 あと、固まるための重要要素ってなんですか？１０％SDSやTEMEDは固める要素として重要ですか？教えてください。よろしくお願いいたします。
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- takes87
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固めるのに重要なのはAPSとTEMEDです。それとアクリルアミド以外の成分は特にゲル化には関係はありません。混合した溶液中に酸素があるとAPSから発生したラジカルがすぐになくなってしまうのでアクリルアミドが固まらなくなります。したがって混合した溶液を減圧下で10分ぐらい脱気することにより溶液に溶けている酸素がかなり除かれるので、固まるようになります。減圧条件はダイヤフラムポンプかアスピレーターぐらいの減圧度で十分です。
- yama06
- ベストアンサー率61% (101/164)
私も昔さんざん作ったのにすっかり忘れてしまいましたが、 TEMEDの保存状態が悪かったり古かったりすると固まりが悪くなるそうです。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=752
