抗体 交差性

質問

以前にも似たような質問が投稿されていましたが、よく理解できなかったので質問させていただきます。

免疫染色かＦＡＣＳを考えているのですが、anti-Ａ（免疫動物rabbit、交差性mouse,rat,human）で染めて、見たいと思っています。

（１）controlはcontrol rabbit IgGでいいのか？
（２）それをFITC anti rabbit IgGでそめればいいのか？
（３）さらにＰＥもしくはPECy7などで別のを染める時はクロスは何を考慮すればいいのか？
anti rabbit IgGのクロスしっかり調べてやりなさいと言われましたがいまいち分かりません。よろしくお願いします。

回答No.2

alanami · ベストアンサー

今はラビットのモノクロも出回っているようですが、免疫動物がラビットということで一般的にポリクロですかね。

（１）コントロールは非免疫のラビット血清で良いと思います。
（２）良いと思います。
（３）質問の意図が良く分かりません。

注意すべきことはポリクロはたとえペプチドカラムを通していたとしても一般的に交差性が非常に高いということです。GPCRなどのモノクロができにくい抗原はともかく、なるべくポリクロは避けてモノクロを使って検討したほうが良いと思います。業者の型に見たい抗原のモノクロがあるかどうか調べてもらうのも手です。
また、FACSを行うのであればマウスならFcブロックは必ず行ったほうが良いでしょう。

お礼

ありがとうございます。なんとかうまくいきました。もちろんＦＡＣＳにおいてはFcブロッキングは行いました。

もっと抗体について勉強しようと思います。

回答No.1

tatoo

抗体を用いた実験でまず念頭に置いておかなければならない考えは、
「このシグナルは本当に目的とする抗原（タンパク質）を認識した結果で見えているものなのか？」
ということです。
いくら抗体がモノクローナル抗体であっても、特異性が高いといっても、このことは絶対に考えなければならないことです。

（１）（２）ですが、ある細胞が抗体自体とよく結合するとしたら（実際、マクロファージは抗体自体と結合するレセプターを持ってますし）、Aタンパク質の存在とは関係なくanti-A抗体によるシグナルが検出されるわけです。その可能性を消すためにcontrolは単なるrabbit IgGで染まるかどうかで検討することになると思います。rabbit IgGで染まればそのシグナルはanti-Aで特異的に染まるものではないということになります。

それ以外に、細胞や組織によっては、それ自体が光るものがあります。自家蛍光と言ったりしていますが、組織によっては何も染めていなくても光って見えることがあります。よく赤血球っぽい細胞？はピカピカ光ります。それは何もしない細胞、もしくは組織を観察すればわかると思います。

他にも、よくよく考えたら可能性があるかと思います。そこは
「このシグナルは本当に目的とする抗原（タンパク質）を認識した結果で見えているものなのか？」
という考えのもと、ネガティブコントロールを計画してみてください。

（３）ですが、FACSで使う（免疫染色ではあまり使いませんね）
PE、PECy7ですが、これも抗体に結合していますので、（１）（２）と基本的には同じです。

お礼

ありがとうございます。抗体の種類の使い方がまだまだ未熟なので、もっと勉強しようと思います。