抗体の切断

質問

実験初心者です。
IgGをペプシン処理で切断したいのですが
その反応時間やpHをどうしようか悩んでいます。
質問は二点です。

１．反応時間は短いのは当然ですが長すぎても問題があるのでしょうか？
２．反応液のpHはペプシンの至適pHで行っても抗体の抗原認識能に影響は出ないのでしょうか？

抗体はマウスIgGです。
基本的なことで申し訳ありませんがどなたか経験者がいましたらアドバイスお願いします。

回答No.3

Peptide · ベストアンサー

1です。
ペプシンが樹脂等に固定されているタイプなら、振盪は必須。
そうでないときも、ゆるやかでよいので攪拌したほうがいい。
ですので、なんとか反応容器を工夫しましょう。
また、一般的に生化学反応では
4度のときは静置、37度など加温するときは振盪攪拌するもの、
という考え方で大方あってると思います。

お礼

ありがとうございました。
またわからないことがあったらよろしくご教授お願いします。

回答No.2

Peptide

１です。
目安ですが、
37度で3時間、SDS-PAGEで150Kのバンドがうすくなってるのを確認。
あまり進行してないなら、オーバーナイトを限度に。
いずれにせよProA/Gアフィニティー精製でそこそこは取れると思います。

お礼

ありがとうございます。
最後にもう一つだけお願いします。
反応させる時は恒温であれば水槽内でなくても出来るのでしょうか？
キットの手順書では試験管を37℃水槽につけて、
中がよく混ざるくらいに揺らして反応させるように書いてあったのですが
うちにある浴槽ではMAXで振っても中身がうまく混ざらないんです・・・

回答No.1

Peptide

Fcに対してFabは酸に対して抵抗性がありますが、
さすがにペプシンの至適pH付近では少なからず変性が進みますので、
長くないほうがいいでしょう。
初めてならば、Pierce社のキット等、確立した手順に基づいて
教科書的に行うことが大切と思います。

参考URL：

http://www.technochemical.com/pierce/antibody/fragmnt/frgmnttn.htm

お礼

お返事ありがとうございます。
キットでもやるつもりなんですがキットの手順書をみても
反応時間が分かりませんでした。
とりあえずキット反応時間をいろいろ試して行おうかと思います。