pSectag2B を用いたベクター構築と組み替え蛋白質を用いた抗体作成

質問

現在pSectag2B発現ベクターを用いた組換え蛋白質の発現ベクターを構築しようとています。
(http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/V900-20_001.shtml)

現在プライマーの構築を行っている段階ですが、どの制限酵素サイトをつけるかを考えています。
ＭＣＳの中央のあたりでつなげなければ(たとえばpSectag2BでいえばBamHIとXhoIの組み合わせ)、
N末C末両端に余計なアミノ酸残基が引っ付いてきてしまうと思います。
また、Histagとのリンカー部位も入ってきてしまいますので、生理活性に影響が出ないか少々心配なところです。
ORFの上流はできる限りシグナル配列の直下につなげたほうが良いのでしょうか？
また、リンカー配列もできるだけ短くしたほうが生理活性に影響が出る可能性は少ないのでしょうか？

さらに、上記の方法で作成した組換え蛋白質(仮に蛋白質Aとしておきます)を抗原としてマウスモノクローナル抗体(中和抗体)を作成しようと考えています。
抗原がマウスのもつその蛋白質Ａとホモロジーが非常に高いため、リンカー配列などを認識してしまうのではないかと考えています。
ホモロジーの高い抗原を用いて抗体を作成するのはやはり難しいのでしょうか？
ラビットのポリクロ抗体でも作ったほうがいいのでしょうか？

念のため類似した質問がないか確認はしましたが、重複していたらすみません。
色々とあつかましい質問ですが、よろしくお願いいたします。

回答No.2

stringf35

生理活性やリンカー長に関してはotx様ご回答の通りだと思います。

抗体に関しては、マウス蛋白質Ａと似ているために抗原性を持たない
のではないか、ラビットポリクロの方がいいのか、とのことですが、
おそらくラビット蛋白質Ａもヒトと似ていると思われます（確証は
ないですが）。

ポリクロの場合、様々なエピトープを持ちますので、リンカー部分を
認識する抗体が大量に産生されて、蛋白質Ａに対する抗体がわずかで
あった場合、タイターはむしろ上がりにくいかもしれません。

マウスモノクロの方が、数は少なくても蛋白質Ａに対するクローンさえ
とってしまえば、リンカー部分へのクロスを心配する必要がないと
思います。ハイブリドーマのスクリーニングをリンカー抜きの蛋白質Ａ
でやる必要がありますが…。

回答No.1

otx

生理活性についてですが、
はっきり申し上げて「タンパク質によりけり、やってみないとわからない」と思います。

参考までに、
ツーハイブリッドやフレットなどで使うフージョンプロテインは
タグなどの構造と自分のタンパク質の構想がそれぞれ独立して存在するようにするために、リンカーをあえて入れます。
フレットの場合だと５つくらいのアミノ酸、プロリンとか。
この辺はきちんと調べてください。

しかしながら、こういうことは、全く同じタンパク質を使っている人がいて、そして同じような実験をした経験からしか
アドバイスできない部類の質問です。タンパク質の性質の多様性はご存知であると思います。

ですので、同じような実験をしている論文や、研究室を見つけ無ければならないと思います。

次の質問についても同じです。
ただ、抗体作製に関しては、そもそも同じ抗原を使ったとしても
出来ないときは出来ないですし、出来るときは出来るものです。
やってみないとわからないと思います。

なので、みんな複数の動物種、複数の個体、を使ってやっていると思います。