酵素活性によるLDHの比活性と純度の表し方。

質問

はじめまして。どうぞよろしくお願いします。
参考文献が借りられていたため非常に困っています。。。
教えていただければ幸いです。

学校の学生実験で電気泳動の実験をしました。
この実験での電気泳動は「ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動」です。
流したサンプルはウシ血清アルブミンです。
このウシ血清アルブミンを粗抽出液、硫安分画、素通り画分、Wash 1、Wash 2、E 1、E 2、E 3、E 4に分けました。
このときの分離はセルロースクロマトグラフィーによって行いました。
電気泳動を行った後、今まで5個あったバンドがE 1以降においてバンドが一個消失しました。
硫安分画の飽和は60％です。
クロマトグラフィーはDEAEセルローズ(陰イオン交換樹脂)カラムクロマトグラフィーです。
透析後の遠心上澄みを添加して酵素を吸着させました。
電気泳動を行ったのは粗抽出液、硫安分画、素通り画分、Wash1、Wash2、E1、E2、E3、E4の全てです。
泳動パターンはE1より前のすべてが同じような電気泳動パターンを示しました。

また、LDHの比活性を計算したところ、粗抽出液、硫安分画、素通り画分の中でもっとも比活性が高かったのは硫安分画。もっとも低かったのは素通り画分でした。
この違いはLDHの含有率だと思いますが、あたっているでしょうか?

また、精製酵素の純度はどのようにして求めることができるのか。
教えていただけないでしょうか?

回答No.2

geneticist12

総タンパク質のうち、その酵素の占める割合が高いほど酵素の純度が高いといいます。酵素の存在量は酵素活性で計るので、総タンパク量あたりの酵素活性、すなわち比活性が高いほど純度が高いと言えます。いくら酵素タンパク質の存在比率が高くても、失活していて活性が低くなっていれば純度が高いとはいいません。

＞この違いはLDHの含有率だと思いますが、あたっているでしょうか?

上記のように比活性は「失活していない」酵素の含有率を反映しています。

実験のねらいは、おそらく精製の段階を進めていくうちに比活性が高くなる、比活性が高い分画をとることができるということなのでしょうが、その点はうまくいかなかったようですね。硫安沈殿を越える比活性をもつ最終分画はとれなかったようですから。

これはおそらく、精製過程で酵素の変性、失活が起こっているのだと思います。ご存じかと思いますがLDHは4量体で種類の違うサブユニット（AとBとしましょう）の組み合わせで５種類のバンドが非変性条件の電気泳動ででます。すなわち、AAAA, AAAB, AABB, ABBB, BBBBBです。たとえば4量体を構成するサブユニットがばらばらになってしまうと（これは比較的起こりやすい）タンパク質としては存在していても酵素活性は示しません。

＞また、精製酵素の純度はどのようにして求めることができるのか。

ふつうは比活性を純度の指標にします。市販の酵素でもそうです。

回答No.1

americam

>また、LDHの比活性を計算したところ、粗抽出液、硫安分画、素通り画分の中でもっとも比活性が高かったのは硫安分画。もっとも低かったのは素通り画分でした。
この違いはLDHの含有率だと思いますが、あたっているでしょうか?

比活性とは、そのフラクションにおける、LDHの活性/全タンパク量 なので、LDHの純度を表している事は分かりますか？
ですので、硫安分画で比活性が最も高いという事は、あなたの言うとおり、LDHの割合が最も高いという事で間違い無いと思います。

＞また、精製酵素の純度はどのようにして求めることができるのか。

もちろん、先ほど述べた通り、比活性が酵素の精製度の指標になるわけです。例えば、最も比活性が高かった硫安分画のサンプルをさらにイオン交換クロマトグラフィなどで分画しますよね。そこで得られたフラクションの比活性を再び求め、そして最も比活性の高いフラクションのサンプルを○○クロマトグラフィによって精製して…
このような精製操作を繰り返していけば、いずれ比活性の値が変わらなくなってきます。
それは、その画分のタンパク質は、およそ全てLDHであると言う事を示しています。

素人の意見ですので、もしかしたら間違ってるかもしれません。
しっかりとあなた自身で吟味してみて下さい。