吸光光度法の検量線について

質問

検量線を作成し、データーにばらつきが生じた場合はどのようにすべきなんでしょうか。無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが・・回答をお願いします。

回答No.2

kgu-2 · ベストアンサー

検量線を引くための標準液は、0を含めて、６点取っています。標準液を調製しやすいように、例えば、0、1、2、3、4、5 mg/mlなど。これを５点検量(0は、普通対照に利用するので)と称しています。４点の場合もあります。
　基本は、グラフを書いて、１点がヅレていたら、それは無視して検量線を引く。２点ズレテイタラ、こりはヒドイので、やり直す、と言うのが教科書です。

　正確にするために検量線を２連(2回)して、その平均を取る、というバカな教えをする教員もいますが(それなら、２連より１０連、１００連の方が正確、と毒づいています)。

　実験のテクニックが難しくて、全体がばらつく場合もあります。この場合は、５点ではなく、１０点とか、測定する回数を増やしたりして、信頼性を高めるしかありません。検量線は、もちろんパソコンで引きます。また、サンプルの測定も、一回だけではなく、数回測定して、平均値を去る必要があります。

　化学反応は、バラツキマセン。しかし、生物のサンプルは、個体差があるので、最低３回は測定して、平均と標準偏差を示します。例えば、血糖値を測定するときに、血液中のグルコースの測定は、ばらつかないので１回で十分。しかし、A、B、Cサンそれぞれの値は異なるので、ヒトの血糖値となると、最低３人は測定しなければなりません。
　同じサンプルを測定して、値がばらつくのは単に腕が悪いだけです。学生だと5%程度、慣れると2%以内、分析のプロだと0.5%の誤差でもウルサク言います。
データがばらつく原因を考え、検量線とサンプルの測定回数を決めてください。

>無理やり線でつなぐのかなと思っているのですが
測定した点をつないだりしているのでしょうか。それはヤリマセン。昔は、測定した点の近くをなるべく通る直線(場合によっては曲線)を、慣れを頼りに引いていました。今ではパソコンがあるので、回帰式を出します。これが検量線になります。最近は、機器に検量線を自動的に描き、濃度まで計算しているのが、普通です。
　回帰式の相関係数が、0.98以上あれば信頼していますが、0.95だとやり直すかどうか迷います。

お礼

ご回答ありがとうございます。
やはり、難しいため全体にばらつきがでてしまうのは仕方ないのですね。残念なことに、私の班はずれが６箇所中２箇所あるのできれいなデータになりませんでした。
回帰式とは何でしょうか・・よければ教えていただきたいです。
基本から教えていただいてとても参考になりました。

回答No.5

kgu-2

>回帰式とは何でしょうか・・
　xとyの関係を数式で表したものです。xに値を入れると、yの値が出て、予想することができます。株価の予想も可能ですが、当たるとは限りません。
検量線は、回帰式を標準液の濃度をx、測定値がyです。
　回帰式を求めるは、先の方が書き込まれているように、最小２乗法を用います。分析機器に組み込まれているものは、おそらくこの方法でしょう。

　エクセルの場合は、yに対するxの回帰なので、最小２乗法とは違うと想うのですが(未確認)、検量線がきちんとひけている場合は大差が無いので、エクセルの場合は、そのまま利用しています。

　回帰式を描くには、
1) 散布図を描く
2) グラフをクリツク(８本の柱(正式名は知らない)が建つ)
3) 一番上のメニューバーの「グラフ(C)」をクリツクし、それにぶら下がっている「近似曲線の追加」をクリツク
4) 「種類」をクリック(直線回帰に設定されており、検量線はこれでOK)
5)　「オプションのタグ」をクリツク
6) 「グラフに数式を表示」する、にチェック
7) 画面右下の「OK」をクリツク　　すると、グラフ上に数式が表示されます。

6)の時点で
　グラフにR-2乗を表示する、をチェックすれば、R-2乗が表示されます。相関係数Rと決定係数R-2乗は、使い方が違うのですが、相関係数Rを２乗したものが決定係数R-2乗なので、計算は単純です。

また、検量線は、切片が0のハズなので、6)の時点で、切片(S)を0として、ボックスにチェクをいれるべきかも。ただ、どのように補正しているのかは知らないので、私は入れませんが。

　以上がエクセルの方法です。しかし、実際には大変です、というのは、普通の検量線の図は、濃度既知の標準液がX、吸光度がyだからです。すなわち、xからyを求めるのが回帰式ですが、求めたいのは吸光度yからその濃度のxを求めたいのです。
　そこで、私は、通常の検量線の図とは逆ですが、吸光度をx、標準液の濃度をyとなるように散布図を描いて、y=ax+bの式をエクセルで求めています。
　aとbの値は、上記1)～6)でグラフ上に表示されるので、その値を用い、xに吸光度を代入して、サンプルの濃度を算出しています。

　最近の吸光度計は、検量線が組み込まれているので(学生実習用のものは、安価なので組み込まれていない場合も)、サンプルを測定すれば、その濃度が自動的に計算されます。この濃度と、上記の方法の値は微妙なズレがあると想いますが、誤差範囲でしょう。

お礼

ご回答ありがとうございます！！
なるほど・・・なかなか大変ですね。
さっそく検量線を作ってみたいと思います。

回答No.4

elpkc

すでに回答のとおり、
最小自乗法で引くのが適切です。
計算はexcelで出来ます。

定量法として、バリデートされた方法として認められるのは、
相関係数r=0.997以上です。
測定点数は、5点以上。

これは、分析法バリデーションの国の通知としでています。

お礼

ご回答ありがとうございます。
計算はexcelはどのようにすればいいのでしょうか？
excelで検量線を引いてみたのですが、点だけになってしまいました。

回答No.3

10D

吸光光度法の検量線は直線になると思いますが、線形最少自乗法により引きます。この検量線（回帰直線）と測定値との差の二乗の和；R^2が１に近いほど検量線として優れています。R^2が0.98以上なら検量線として使えると思います。
自分で計算すると大変ですが、カレイダグラフなどのソフトを使えば簡単にできます。

お礼

ご回答ありがとうございます。
カレイダグラフのソフトはダウンロードするのですか？

回答No.1

takenobupapa

検量線のデータがばらつくのは、実験方法、実験技術、実験装置、試料調製のいずれかに問題があるからです。また、そのような状態で実際の測定を行っても得られたデータは信用できません。従って、きれいな検量線が得られてから測定を行うようにするべきです。検量線を作り直しましょう。

お礼

回答ありがとうございます。
とても参考になりました！！