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制限酵素について
実験、サンプルなどによると思いますが、 よく使う制限酵素とは何ですか? 制限酵素の4天王みたいなものはあるんですか? 平滑末端にするやつはあまり使わないらしいですが。 また、BSAを入れる場合がありますが、 これは何のためなんですか?
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目的が達成できるならHind3です。これが一番圧倒的に一般的且つ安価です。
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- Dr_Hyper
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補足です。 平滑末端では、末端の突出が無いためにライゲーション効率が落ちます。が一方で、ベクターもインサート(クローニングしたい断片)も平滑末端であれば、どのような酵素で切断してもライゲーションできるというメリットがあります。一般的に御答えしようと思えば、うまく突出末端を持った酵素でうまく組み合わせてライゲーションできるのであればまずそちらが優先。どうしようもない場合には平滑末端を使用してつくります。TAクローニングというのはtaq DNAポリメラーゼが無関係に最後にAをつけてしまう性質を利用してベクターをT突出にしておいてPCR断片であればどれでも簡単にクローニングできる方法です。
お礼
TAクローニングはPCR産物でないできないんですか?
- Dr_Hyper
- ベストアンサー率41% (2483/6032)
制限酵素の値段を見てください。TOYOBOでもTAKARAでもNEBでもなんでもいいです。EcoRI XhoI...安いのは昔から精製技術も確立され、そのため需要も多く、新しくベクターを作る際も、それらが入るような工夫をする場合が多いと思います。平滑末端はライゲーション効率が悪くなりますが、TAクローニングの技術がなかったころ、多くのPCR産物や切り出した断片はEcoRV, SmaIなどを使用することが多く、目的によります。 BSAは一般に安定化と言われます。実際に最小量の酵素を入れてunitぎりぎりで使用した場合有効なものがあります。チューブに少量のタンパク質を入れるとくっついてしまうのを防いでいるのではとも考えられています。結果として酵素が効いたので、安定かといっている方が今は多いのかもしれませんね。
お礼
Nru1とかは高そうですね。 平滑末端のライゲーションはあまり用いられないのですか。 平滑に切る酵素は安いがあまり使わないということですか? TAクローニングとはどのような技術なんですか?
これこそ人により、使用するベクターにより様々だと思いますが、比較的マルチクローニングサイトに用いられる制限酵素サイトにはEcoRI、Xho I、Nde IやBamH IIなどをよく見かける気がします。 BSAは酵素自身を安定化させるために添加しますが、自分でもいろいろな酵素で試したところ、なくても大丈夫な気がします。
お礼
BSAはなくても大丈夫なのですね。 しかし、忘れないように気を付けなくてはいけないですね。
- yakyutuku
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制限マップ作ってシークエンスでもするのかな?Hind3 Not1 Bamh1 Kpn1なんかよく使いますね~。平滑は、くっつきしどこでくっつくかわからないので極力使いません。 BSAは制限酵素がタンパク質分解酵素などにより分解されるの防ぐために使います。英語のマニュアル読めばわかると思いますよ。
お礼
平滑末端のライゲーションで挿入向きを確認するのに使います。平滑末端は効率が悪いけどやらされています。 NruIとか使いますか?
お礼
平滑に切るやつが安いんですか? NruI、XhoIとかも安そうですが。