ベストアンサー PCR産物から1ugのDNAを得る方法 2006/09/13 08:33 FISHに使うためのプローブを作製するために1ugのDNAが必要なのですが、PCR産物から1ugのDNAを得るためには普通どのような作業をするのでしょうか? みんなの回答 (1) 専門家の回答 質問者が選んだベストアンサー ベストアンサー MIYD ベストアンサー率44% (405/905) 2006/09/17 08:24 回答No.1 テンプレートの量とサイクル数の検討をします。 テンプレートを多めにして、サイクル数を減らしたほうが、 きれいなPCR産物を得られることが多いかと思います。 FISHはやったことがありませんが、 PCR後に電気泳動して切り出すことがあります。 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 カテゴリ 学問・教育自然科学生物学 関連するQ&A 1ugのDNAを精製するには? FISHに使うためのプローブを作製するために1ugのDNAが必要なのですが、1ugのDNAを得るためには普通どのような作業をするのでしょうか? DNAプローブの合成で DNAプローブを作ろうと考えています。DNAプローブを作るときは、1本鎖のDNAをラベリングしなければならないらしいのですが、PCR産物(あるいは精製したもの)を加熱して一本鎖にすれば良いのでしょうか? また、参考にしている論文では、PCR産物をベクターでクローニングしたものをラベリングしているのですが、何故でしょう? DNAプローブの作り方 初めてサザン法を行い、またそれに使うDNAプローブをPCR産物から作るのですが、疑問があります。 (1)DNAを一本鎖にするために、熱変性し、キットを用いて標識するのは分かるのですが、それを氷上において一本鎖に保ちます。それを、ブロッティングしたメンブランにアプライするわけですが、いくら一本鎖にしたといえ、プローブ同士が二本鎖になることはないのでしょうか? (2)上記のようにPCR産物から作成したプローブはセンス鎖もアンチセンス鎖も混ざっているというわけですよね? (3)泳動した二本鎖DNAのゲルをアルカリ変性させ一本鎖にしますが、これをメンブランに移したということは同程度のバンドの位置に解離した二本鎖があるわけで、そこにプローブ(アンチセンス鎖もセンス鎖も含む)をアプライしたらバンドは二本観察されるのではないのでしょうか? 初心者的な質問で恐縮ですがよろしくお願いします。 天文学のお話。日本ではどのように考えられていた? OKWAVE コラム PCR産物を電気泳動すると・・・ PCR産物を電気泳動すると、ひきずって流れているように筋のようなものができて流れていきます。 バンドも見えるのですが、筋があるのではっきりとは見れません。 ちなみにゲルはすでに作られているものを用いているので、ゲル以外に原因があると思っています。しかし、PCRにかけるときはプライマーとDNAとmilliQしか入れていません。 同じような経験がある方、原因がわかる方いらっしゃったらお願いします。 PCR産物4の制限酵素処理について ヒトの細胞からゲノムDNAを抽出し、PCRにて増やしたDNAを制限酵素処理しているのですが、上手くいきません。どなたかご指摘の方お願いします。 制限酵素名:KpnI 10×L buffer 1μL PCR産物(フェノクロ処理、エタ沈、真空乾燥し滅菌水に溶かしたもの) 8μL KpnI 1μL 反応時間:1時間 これで行っているのですが全く切れません。試しに一日置いたのですが、全く一緒でした。 ちなみにKpnIは別の人が、プラスミドを切るのに使って、成功したので、失活はないと考えられます。 また、PCR産物も確認したところ目的とするものでしたので、PCRは成功してます。 DNAプローブの作製法 FISHに使用するDNAプローブを作製するとき、DNAサンプルのインサートはベクターから切り離した方が良いのでしょうか?インサートは2kbpほどです。また、インサートを切り離す場合、制限酵素で切断した後どのような作業をすればよいのでしょうか?または制限酵素で切断してすぐにラベリングしても大丈夫なのでしょうか?本を見ても書いてないので困っています。 PCRの実験について 学校のレポートの問題が解らず困っています。 PCRという実験系に関する一般的な意義について、 サンプルDNAでPCR産物が認められ、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方でもPCR産物が認められたとする。この状況でDNAの結果を信頼してよいのはどのような場合か?少なくとも2種類の電気泳動パターンを図示し、説明せよ。 という問題です。ネガティブコントロールでPCR産物が認められているのに、結果を信頼してよい場合なんてあるんですか?よくわからないので教えてください。図の書き方についてもアドバイスいただけると幸いです。 DNAシーケンスでのBigDye で使うポリメラーゼ 実験初心者です。DNAのシーケンシングを行う際に、Big Dye 3.1 というものを入れ、それに目的のDNAとプライマーを入れた溶液を作製し、PCRを行いました。ここで疑問が出てきたのですが、PCRを行う際にはDNAポリメラーゼが必要ですよね? 普通のPCR反応ではポリメラーゼを別に加えるのにここでは加えていません。Big Dye の溶液の中に含まれているのでしょうか? 調べてもBig Dye に含まれる成分が全く出てこなかったので、困っています。もしDNAポリメラーゼが含まれているなら、何の生物由来のものかなども分かると嬉しいです。 アガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ 600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動(1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。 分子量で見ると、産物のバンド(600 bp)に加えて、450bp程度のバンドが新たに出現します。精製中に分解したのでしょうか?(でも、DNaseのコンタミだったらもっとズタズタに切れますよね)。それとも、精製過程で産物の一部が何か高次構造のようなものをとって、電気泳動上で二本になって見えるのでしょうか? 原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。 in situ probeの作り方 in situ 用のRNA probe作製についての質問です。 現在行っているprobe作製の手順ですが、 (1)SP6およびT7の配列を組み込んだPCR primerを使って、目的の配列とpolymeraseの配列を含んだPCR産物を得ます。 (2)このPCR産物をin vitro transcriptionのtempleteとして用い、RNAを合成します。 (3)RNA columnにより精製し、最後にgel上でバンドの確認をします。 この最後のgel上での確認の際、バンドが2本見えます。1本は目的のサイズです。スメアではないのでRNAが分解したものではないと思います。 DNAのコンタミかと考え、in vitro transcriptionの試薬を新しくし、再試行しましたが、同じ結果となりました。 どのようにしたらこの問題を解消できるのでしょうか。 in vitro transcriptionの前にgel extractionによりPCR産物は精製しているので、全く異なる配列のRNA産物ではないと思うのですが、このままin situに使えますか? もし、シグナルが得られても結果に自信が持てない気もしますが。。 よろしくお願いします。 2段階PCRについて 少々汚いDNAを鋳型に用いてPCRをしています。 増えが悪いときに、PCR産物を鋳型に同じプライマーを用いて2段階PCRをすることで、ほとんどのサンプルが増幅してくれます。 それで、この結果を元に論文を書こうと思っているのですが、なぜ2段階PCRをすることでPCRの結果が改善するのかという引用文献が見つけられません。 2段階PCRは感度が良いと言われていますが、そうきちんと書いてある文献や、なぜ感度がよいのかを書いてある(議論している)文献をご存じの方、教えていただけませんでしょうか。 DNA断片をPCRで増幅し、増幅したものを電気泳動で確認するとバンドが DNA断片をPCRで増幅し、増幅したものを電気泳動で確認するとバンドが確認できました。 そのPCR産物を使ってベクターにサブクローニングしたのですがまったくライゲーションできませんでした。 用いた方法はTAクローニングシステムです。 なぜサブクローニング出来なかったのか考えているのですが、PCR反応の際に用いたDNAポリメラーゼが3'にアデニンをうまく付加出来ないということはありえるのでしょうか? 他に原因が思い浮かびません。 どなたかアドバイスいただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。 日本史の転換点?:赤穂浪士、池田屋事件、禁門の変に見る武士の忠義と正義 OKWAVE コラム DNA配列決定とPCRの関係 未知の配列を調べる(決定する)ために 抽出したDNAの量が少ない場合は PCRが必要ですが、 未知の配列なのでprimer配列も決めることが出来ず、 primer配列を決めることができぬならば 増幅したDNAを使った配列決定も出来ぬという話になります。 結局、PCRが不必要なほどのDNA量が抽出で得られぬならば 未知の配列を調べることもできぬ。 この理解には根本的な誤解が有りますか。 DNAをいじったことが無いので易しい解説をお願いします。 PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNA PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNAを抽出しPCRを行うという実験で、うまくいかず行き詰っているので質問させていただきます。 現在以下の条件でPCRを行っているのですが、うまくいきません。 組成 forwardプライマー:1μL(=1pmol/μL) reverseプライマー:1μL(=1pmol/μL) Go Taq 5xBuffer:10μL dNTP:5μL(final濃度で200μM) Go Taq DNA polymerase:1μL 鋳型DNA:1μL MgCl2:3μL 滅菌水:28μL 計50μL 反応 ・反応 96℃:5分 ↓ 25サイクル 96℃:1分 55℃:1分 72℃:1分 ↓ 72℃:5分 ↓ 4℃: 設計ではPCR産物の長さは約100塩基ですが、これを行うと50塩基のPCR産物が検出され、100塩基のものはまったく確認することができませんでした。 また、プライマーの長さは約20塩基です。プライマーのTm設定はアニーリング温度を55℃と設定して、それよりも+5℃のTm値を持つよう設計しました。 同様の質問をyahoo知恵袋でも行いまして、回答してくださった皆様の条件でも行いましたが、いずれも同じ結果となってしまいました。 http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q1449649784 また、最近sigma社のXNATR REDExtract-N-AmpTM Tissue PCR Kitの組成液にプライマーと細胞抽出液を入れてPCRを行いましたが同じ結果でした。 原因、改良点の指摘がありましたら是非教えていだけますでしょうか? DNAの分子量の出し方について PCR産物のマーカーDNA断片による分子量測定について質問です。 現在研究においてHPV遺伝子の検出を行っています。 組織片からDNAを抽出→PCRで増幅→電気泳動→エチジウムブロマイドで染色→UV照射→バンドを確認→写真をプリントといった手順で行いました。 その後、写真を用いてマーカーDNA断片とPCR産物の移動度を定規を用いて計り、片対数グラフを用いてPCR産物の分子量測定を行ったのですが、手書きで行ったため思ったような結果が得られませんでした。 いいグラフの書き方又はグラフでの分子量の測定以外の求め方を御存知の方がいましたら回答よろしくお願いします。 細菌からのDNA抽出→PCRで 初歩的で申し訳ありません。 細菌からDNAを抽出した時そのDNAは環状2重らせんDNAなのでしょうか。 次にPCRで熱をかけた時も解けたDNAは1本ずつ環状のまま解けているのでしょうか? そして増幅される時はその環状DNA全てが複製されるのですか?それとも必要な部分だけ増幅されるのでしょうか?もしかしてプライマーを付けることによって必要な部分だけ増幅しているのですか。 定量PCRのスタンダード作製 最近、リアルタイムPCRで増幅産物の定量を行うようになったのですが、 市販されているプライマーとスタンダードのセットでしか測定をしたことがありません。 自身でデザインしたプライマーで増幅した産物の定量を行いたい場合、 スタンダードはどのように作製したら良いのでしょうか? PCRの増幅産物をプラスミドにクローニングしてスタンダードを作製するようなことを読んだのですが、悲しいことに理解できずにおります。 また、塩基配列が判明している変異遺伝子やウイルス検出にあたり、手元に陽性コントロールとなるサンプルがないとスタンダードを作ることは無理でしょうか? 具体的な解説、初心者向けのおすすめ書籍・webサイト等がありましたら、教えてもらえないでしょうか。 PCR、プライマーとDNA複製について PCRでは、5'プライマーと3'プライマーが必要だと思うのですが、これは、2本鎖DNAのそれぞれにくっつくだけ、と理解しています。 高温でのDNAの分離と、温度を下げてのアニーリングの後、ポリメラーゼが、複製の過程でプライマーから新しいDNAを作ってゆく、と思うのですが、ここまではいかがでしょうか。 問題はここからなのですが、プライマーはそれぞれ片方しかついていないのに、なぜ、両方とも同じ長さだけ作られることになるのでしょうか? 換言しますと、たとえば片方の5’プライマーから作られたDNAは、なぜ、3’プライマーと同じ塩基配列の部分まで作ったら、複製の過程が終了するのか、という点が疑問です。 ご存知の方、よろしくお願いいたします!! PCR&電気泳動について 電気泳動について質問です。3種類のプラスミドDNAについて、同じプライマーを用いてPCRを行いました。このバンドを電気泳動してみたところ、2種類のプラスミドDNAに関してはクッキリと目的バン ドが出たのですが、残り1種類のプラスミドDNAの増幅産物にかんしては、薄い目的バンド➕スメアが観察されました。この原因として考えられるのは何でしょうか?自分が考えているのは、プライマーや酵素には問題がないと思うので(他2種類のプラスミドDNAのPCRはうまくいった。)、テンプレートのプラスミドDNAの精製度が低いと考えています。現にO.D値も1.72くらいだったので…。なので、プラスミドDNAの抽出からやり直そうかと考えています。 他に何か考えるべき要因があれば、ご教授お願いします! northern blotで用いるprobeの作り方 northern blotで用いるプローブをPCR産物からつくる方法を教えてください。ある薬物をラットに投与すると肝臓内のacyl-CoA oxidase活性が上がりました。RT-PCR(リアルタイムではない)で遺伝子発現が上がっているのは明らかなのですが、定量性に欠けるということで、northern blotをしたいのですが、このときのプローブを作りたいのです。よく論文でPCR産物をプローブにしてノーザンを行っている論文を見ますが(論文では当たり前のようにプライマーの配列が書いてあり、次の文ではP32でラベルし、、、で終わっているものばかりでこの過程がわかりません)、単にPCR産物をアガロースゲルで分け、取りだし、P32あるいはDIGでラベルをするだけでよいのか、あるいは複雑な工程があるのか教えてください。いままでノーザンをしたことはあるのですがプローブはもらいものだったもので大事なことがわかりません。またこのPCR産物をプローブに用いる方法は当たり前なのか、どのくらい量がとれるか(ようは菌で増やさなくてもいいくらいの量か)、欠点、長所、よく書かれた成書があれば教えてください。 注目のQ&A 「You」や「I」が入った曲といえば? Part2 結婚について考えていない大学生の彼氏について 関東の方に聞きたいです 大阪万博について 駅の清涼飲料水自販機 不倫の慰謝料の請求について 新型コロナウイルスがもたらした功績について教えて 旧姓を使う理由。 回復メディアの保存方法 好きな人を諦める方法 小諸市(長野県)在住でスキーやスノボをする方の用具 カテゴリ 学問・教育 自然科学 理科(小学校・中学校)化学物理学科学生物学地学天文学・宇宙科学環境学・生態学その他(自然科学) カテゴリ一覧を見る OKWAVE コラム 突然のトラブル?プリンター・メール・LINE編 携帯料金を賢く見直す!格安SIMと端末選びのポイントは? 友達って必要?友情って何だろう 大震災時の現実とは?私たちができる備え 「結婚相談所は恥ずかしい」は時代遅れ!負け組の誤解と出会いの掴み方 あなたにピッタリな商品が見つかる! OKWAVE セレクト コスメ化粧品 化粧水・クレンジングなど 健康食品・サプリ コンブチャなど バス用品 入浴剤・アミノ酸シャンプーなど スマホアプリ マッチングアプリなど ヘアケア 白髪染めヘアカラーなど インターネット回線 プロバイダ、光回線など